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MTT法实验步骤及方法

发布时间:2022-12-05 10:41:40 阅读:11922次 来源:百度学术

  1: 胰酶消化对数期细胞,终止后离心收集,制成细胞悬液,细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。

  细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。

  对于初学者而言,要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手,我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。

  以一般细胞培养常用的25cm2为例,

  1)细胞密度在长到约80%~90%(下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态),消化离心收集后,将上清去掉,加入3ml培养基使其混匀。

  2)另取一支新的15ml无菌离心管(为下一步接种96孔板用),装入约9ml培养基.

  3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管,混匀后细胞计数,此时一般为或小于5-10×104/ml,该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞(见下图);如果不够该浓度,再根据计数的结果滴加细胞悬液,每滴按50ul计算。

  4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整,如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×104/ml),细胞毒性实验每孔5000—10000个(相当于细胞悬液密度为5×104/ml)。此外,还应根据细胞本身特性,如生长快慢,来决定细胞数量。比如:生长较快的细胞密度可略小。

  2.将细胞悬液制备好后,轻轻混匀,每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。

  注意:因细胞在混匀后仍要继续沉降,因此接种的过程中要反复多次混匀,如每加6个孔就混匀一次,以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同,这对于MTT的结果至关重要。

  3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个,否则难以反应真实情况。下图可做为96孔板的的参考步局。

  对于加药,有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中,以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好,然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基,这样能保证药物浓度的准确。另外,需注意的是,如果用这种方法,不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药,应该吸完一部分后立即加样,避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。

  4.5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。

  5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。

  6. 终止培养,准备溶解结晶。

  溶解结晶的方法有两种,第一种,用DMSO溶解

  1) MTT加入培养4h后,结晶可充分形成。将上清去掉,该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走,也有人建议先铺几张滤纸在桌面,然后将96孔板轻轻倒置,这样上清便被滤纸吸走,以减少结果的损失。个人认为,这两种方法都有可能导致结晶的损失,从而引起结果的不准确。采用哪种方法,可以自己摸索一下再决定。

  2) 每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

  另一种方法,用三联溶解液(见上面MTT甲瓒溶解液)

  1) MTT加入培养4h后,结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉,直接在每孔加入100ul溶解液。(该溶解液因含有SDS,在低温保存的时候易产生结晶,因此在用之前必须提前几小时拿至室温,将SDS结晶全部溶解后再使用。)

  2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时,镜下观察,待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右,紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少,溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多,溶解的时间会长一些。

  在实际的操作过程中,往往为了等待4—6小时,使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值,给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索,加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响,但要注意的是一定要避光,不过培养箱关闭后本身就是闭光的,所以加入溶解液后放入培养箱中,第二天上班时再测OD值就可以了。

  7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1848.html

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