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细胞转染实验怎么做,影响转染的因素有哪些

发布时间:2023-03-21 10:37:39 阅读:13902次 来源:百度学术

  细胞转染定义:将外源分子如DNA RNA等导入真核细胞的技术。

  瞬时转染:外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72h内分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。

  稳定转染:外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,通常需要一些选择性标记反复筛选得到稳定转染的同源细胞系。

  方法及特点:

  化学法:磷酸钙法、DEAE-右旋糖苷法、阳离子脂质体法

  物理法:电穿孔法、显微注射法、biolistic颗粒传递法

  病毒介导法:逆转录病毒、腺病毒

  阳离子脂质体法:带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。过程如下图:

  特点:简单通用,适用性广,转染效率高,重复性好,但转染时需除血清,转染效率随细胞类型变化大。

  脂质体法由于脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会远大于悬浮细胞,所以贴壁比悬浮转染效率要高。悬浮细胞建议使用电穿孔法。

  电穿孔法:利用高压电脉冲对细胞膜的干扰,使其形成利于核酸进入的微孔。

  特点:需要特定仪器,适用性广,除了质粒外,还可转染大的基因组,细胞致死率高。

  逆转录病毒(RNA):通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用进入宿主细胞,之后反转录酶启动合成DNA并随机整合到宿主基因组中。

  特点:稳定转染,可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等,但携带基因不能太大。

  腺病毒(双链DNA):先和细胞表面的受体结合,继而在αV整合素介导下被细胞内吞。

  特点:可用于难转染的细胞。

  转染步骤:DAY-1  铺板

  DAY 0  DNA分子与复合物混合,转染细胞

  After  监测转染水平

  影响转染的因素:

  1、血清  血清影响复合物的形成,降低转染效率

  阳离子脂质体和DNA的*量在使用血清时会有所不同,因此想在转染培养基中加入血清时要进行条件优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康,对于对血清缺乏比较敏感的细胞,可以使用OPTI-MEM I培养基。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞,建议使用LIPOFECTAMINE 2000。

  2、抗生素 比如青霉素和链霉素,是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性,导致转染效率低。

  3、细胞代数  转染前细胞经过1-2次传代保证细胞生长旺盛容易转染,注意贴壁细胞一旦长满就不好转染。

  4、细胞铺板密度  一般转染时,贴壁细胞密度为70%-90%,悬浮细胞密度为2*10^6--4*10^6细胞/ml时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。

  5、DNA质量  DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术基于电荷吸引原理,如果DNA不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成和转染的进行。


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