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非特异性染色(假阳性高)原因

2022-12-18 10:35:37
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  若已知细胞或者组织样本依然处于活细胞状态,但是用TUNEL试剂盒检测,出现了非特异性染色,和处理过的荧光信号一样强,甚至比阳性对照组荧光信号还要强。

图例

  1 样本处理不当

  1)使用酸性或碱性固定液,导致DNA损伤。建议使用pH中性的固定液固定组织或者细胞。

  2)固定液浓度过高,导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议使用4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)。

  3)固定时间过长,导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议控制固定时间在4 ℃放置25 min。

  4)蛋白酶K处理时间过长,破坏核酸结构,出现假阳性。建议适当缩短处理时间。

  5)蛋白酶K浓度过大,破坏核酸结构,出现假阳性。建议适当调整蛋白酶 K溶液浓度,一般工作液浓度为20 μg/mL。

  2 染色操作不当

  6)TUNEL染色时间过长。建议一般是 37 ºC 孵育60 min,可以根据凋亡损伤程度,可长至2 h,但要结合背景着色。

  7)未充分清洗样本。染色后PBS清洗次数可增加到5次,来避免切片的非特异性染色。


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