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荧光信号弱或没有荧光信号是什么原因

2022-12-18 10:27:04
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  若已知细胞或者组织样本处于细胞凋亡状态,但是用TUNEL试剂盒检测发现荧光信号偏弱或没有信号。

   样本处理不当

  1)样本切片太厚。建议适当将切片切薄一点,便于染色。

  2)脱蜡和水化不充分。建议脱蜡先60 ºC 20 min,再使用二甲苯两次5-10 min;而水化用梯度乙醇从高到低浓度浸洗。

  3)Proteinase K的孵育时间过短。优化Proteinase K的孵育时间,常用时间10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min,30μm左右的片子孵育30 min。

  4)Proteinase K浓度过低。建议蛋白酶K一般工作液浓度为20 μg/mL。

  5)放置在-20 ºC保存较长时间的切片不新鲜,减低染色效率。建议使用新鲜切片。

  染色操作不当

  6)染色时间过短。建议一般 37 ºC 孵育60 min,可以根据凋亡损伤程度,可长至2 h,但要结合背景着色。

  7)TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度过低。建议适当提高TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度。

  8)TdT酶失活。建议TUNEL反应液临用前配制,短时间在冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导致TdT酶失活。

  9)样本干燥。加上TUNEL反应液后,请盖上盖玻片/保鲜膜/湿盒中进行,保证样本均匀染色,又可防止反应液干燥。

  荧光检测操作不当

  10)操作未避光。由于荧光易碎灭,建议标记与检测样本时,载玻片要避光,观察时要尽量快。

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