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细胞培养细胞复苏实验步骤

2022-12-08 10:21:34
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  细胞复苏的原则:快速融化

  必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。

  实验前准备

  将水浴锅提前预热至37℃。

  细胞实验室进行常规消毒,用75%酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面,保证无菌。

  在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。

  取出冻存管

  根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。

  从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。

  迅速解冻

  迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。

  约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。

  平衡离心

  用架盘天平平衡后,放入离心机中3000r/min 离心3分钟。

  制备细胞悬液

  吸弃上清液。

  向离心管内加入适量完全培养液,吹打制成细胞悬液。

  用培养液悬液混悬沉淀细胞,细胞计数调整细胞浓度,放入培养箱中培养。

  细胞计数

  细胞浓度以5×105/ml为宜。

  培养细胞

  将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃,5%CO2的培养箱内2-4h(或者24-48h)后换液继续培养培养,换液的时间根据细胞情况而定。

  记录复苏日期

  结果分析

  判断细胞复苏成功与否,需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率(细胞存活率将冻存管内剩余的细胞,台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞,活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞,得出细胞存活率)。

  如果复苏后95%以上的细胞贴壁,而且细胞的活性好,这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长,达到正常的生长特性(比如细胞群体倍增时间等)后要再冻存以补充细胞储存数量。

  ××  初学者易犯错误  ××

  水浴锅未提前预热或者未预热到37℃直接融化。

  水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。

  离心前忘记平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。

  一次复苏细胞种类过多,忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。


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