细胞复苏的原则：快速融化

　　必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

　　实验前准备

　　将水浴锅提前预热至37℃。

　　细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。

　　在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。

　　取出冻存管

　　根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。

　　从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

　　迅速解冻

　　迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

　　约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

　　平衡离心

　　用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3分钟。

　　制备细胞悬液

　　吸弃上清液。

　　向离心管内加入适量完全培养液，吹打制成细胞悬液。

　　用培养液悬液混悬沉淀细胞，细胞计数调整细胞浓度，放入培养箱中培养。

　　细胞计数

　　细胞浓度以5×105/ml为宜。

　　培养细胞

　　将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱内2-4h（或者24-48h）后换液继续培养培养，换液的时间根据细胞情况而定。

　　记录复苏日期

　　结果分析

　　判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞，活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞，得出细胞存活率）。

　　如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。

　　××  初学者易犯错误  ××

　　水浴锅未提前预热或者未预热到37℃直接融化。

　　水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

　　离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

　　一次复苏细胞种类过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。