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紫外分光度法进行蛋白定量的实验方法

2022-11-23 10:27:40
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  蛋白定量是蛋白质检测过程中的重要环节,检测的方法有很多,有Bradford检测法、Bradford斑点试验法、Coomassie 斑点试验法、紫外分光度检测法。其中、紫外分光度法是蛋白质定量方法中比较快的一种方法。

  一、紫外分光光度法进行蛋白定量的检测原理:

  由于蛋白质分子对于不同光度波段的吸光率也有所不同,所以紫外分光度检测法主要通过光系统来检测蛋白分子的吸光率,从而确定蛋白质的浓度进行的蛋白定量。比如205nm的光波波长主要吸光为肽链分子。280nm波长下色氨酸与酪氨酸吸光率则这两种分子以为主。

  二、蛋白定量中蛋白质溶液浓度的确定

  1、纯蛋白质溶液:

  a.在滤光波长为280nm的环境下对比其吸光率。

  b.其中的抗体和BSA,估算公式为:蛋白质 A280 (1mg/ml)IgG =1.35; IgM=1.2; BSA=0.7。(单位/吸光率约等于1mg/ml)

  2、蛋白定量中核苷酸类的蛋白溶液浓度测定:

  a.在280nm和260nm或205nm光波长环境下对照其吸光率;

  b.蛋白质浓度估算公式:

  280nm波长:蛋白质浓度(mg/ml)=(1.55×A280 )-(0.76×A260 )

  208nm波长:蛋白质浓度(mg/ml)= A205 /(27 + 120 A280/ A205 

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