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PCR的有哪些基本类型,附PCR实验中常见问题解决方法

发布时间:2022-11-23 10:30:32 阅读:1582次 来源:百度学术

  PCR 或聚合酶链式反应是分子生物学中用于创建特定 DNA 片段的多个副本的技术。这项技术是由USA生物化学家 Kary Mullis 于 1983 年开发的。通过PCR仪进行PCR 使产生数百万份 DNA 小片段成为可能。所以PCR仪也是分子生物学和生物技术实验室常用于见的实验室设备。

  PCR的原理

  PCR 技术基于 DNA 的酶促复制。 在 PCR 中,使用引物介导的酶扩增一小段DNA 。DNA 聚合酶合成与模板 DNA 互补的新 DNA 链。DNA 聚合酶只能将核苷酸添加到预先存在的 3'-OH 基团上。因此,需要一个底漆。因此,更多的核苷酸被添加到 DNA 聚合酶的 3'''末端。

  PCR实验主要由三部分所组成:

  1.DNA 模板– 样本中单链DNA。

  2.DNA 聚合酶–使用 Taq 聚合酶。Taq聚合酶属于热稳定酶,在较高的温度下不会变性。

  3.寡核苷酸引物s - 这些是与单链和反链的 3' 末端互补的短链单链 DNA。

  4.脱氧核糖核苷酸三磷酸——它们为聚合提供能量,是 DNA 合成的基石。

  5.缓冲系统——镁离子和钾离子为 DNA 变性和复性提供了良好的环境条件。它对于保真度、聚合酶活性和稳定性也很重要。

  PCR的基本类型

  PCR有以下几种类型:

  1.实时荧光定量 PCR

  实时荧光定量 PCR,在荧光检测系统的帮助下实时检测 DNA 扩增。荧光报告基因的信号强度与扩增的 DNA 分子数量成正比。该实验中所使用的PCR仪器一般是荧光定量PCR仪。比如:朗基的A600 PCR仪

  2.嵌套 PCR

  通过嵌套PCR可以提高样本的敏感性和特异性。由于意外引物结合位点的扩增,减少了产物的非特异性结合。

  3.多重PCR

  使用多通道高通量的PCR仪可以实现同时扩增许多不同的 DNA 序列。也可以用于在单个 PCR 实验中扩增多个目标。比如朗基的T30系列PCR仪

  4.定量 PCR

  定量PCR主要用于通过 DNA 扩增线性来检测、表征和量化样品中的已知序列。

  PCR基因扩增步骤

  PCR PCR基因扩增主要经过3个循环反应:

  变性

  当反应混合物加热至 94℃ 约 0.5 至 2 分钟时发生变性。这会破坏两条 DNA 链之间的氢键并将其转化为单链 DNA。此时,单链作为产生新 DNA 链的模板。此阶段应提供较长时间的温度以确保DNA链的解离。

  退火

  通过PCR仪设定的程序将反应温度降至54-60℃约20-40秒。在这里,引物与模板 DNA 上的互补序列结合。引物是长度约为 20 至 30 个碱基的 DNA 或 RNA 的单链序列。

  引物是 DNA 合成的起点。DNA链分开后以相反的方向运行,因此引物设计一般有两个,即:正向引物和反向引物。

  延伸

  在这一步,温度升高到72-80℃。Taq 聚合酶将碱基添加到引物的 3' 端。

  这会在 5' 到 3' 方向上拉长 DNA。DNA聚合酶在适宜的温度下增加约1000bp/分钟。

  Taq 聚合酶可以耐受较高的温度。它附着在引物上并将 DNA 碱基添加到单链中。从而获得了双链DNA分子。

  这三个步骤一般重复 20-40 次,即可在短的时间内获得许多目标的 DNA 序列。

  PCR技术的应用

  PCR技术主要应用于以下领域:

  l 药物

  l 遗传病突变检测。

  l 基因检测

  l 检测父母的致病基因。

  l 法医学

  l 用作基因指纹识别的工具

  l DNA鉴定

  l 亲子鉴定

  l 研究和遗传学

  l 在基因组研究中比较两种生物的基因组

  l 用于任何来源(例如化石)的 DNA 的系统分析

  l 基因表达分析

  l 基因图谱构建

图例

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1807.html

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