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细胞计数丨浅谈细胞计数之定量问题

2022-06-01 10:37:19
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  根据国内标准GB/T39730-2020和国际标准ISO20391-2对于细胞计数的要求,细胞计数准确性的前提是定量问题。目前市场上的细胞计数均利用不同的技术体系,以满足不同程度的定量要求。目前常用方法有:细胞计数板、细胞计数仪以及流式细胞计数,下面我们就针对这几种不同方法对其定量问题进行讨论。

  首先是细胞计数板,细胞计数板的定量关键在于装片和加样两个手工操作步骤。装片是我们将计数板的载玻片和盖玻片组装在一起,错误做法是先加样再压片。为什么说加样后压片的方法不可取,这必须先了解下计数板的定量和计数原理。

  图例

  计数板的定量是通过L区,1mm*1mm的面积,结合100μm的厚度进行0.1μL的体积定量,而后通过区域内的数目进行细胞浓度的换算,再结合4个0.1μL区域的计数重复,求得最终平均值,得到细胞浓度。如果先加样再压片,计数室的厚度不能保持100μm,整个细胞分布水平就会发生变化,引起计数结果不稳定或不准确。因此,在装好片的条件下,加样时也需要保证盖玻片不发生位移,以免计数室的体积及样本分布发生变化。加样是计数板的另外一个重要操作,在计数板加样过程中,加样位置和加样体积都会影响样本分布及定量。

图例

  加样时,定量10μL的样本,移液器倾斜45°左右,在加样区靠近盖玻片边缘加样,使得样本靠毛细力进入计数区,如有气泡则需重新清洗计数板,重新加样。

  国产细胞计数板通常不配备相配套的盖玻片,而进口计数板通常一个计数板配备两块匹配的盖玻片,就是为了保证盖玻片和计数板之间的距离在100μm左右。进口计数板工艺水平和价格较国产计数板高,刻度线也相对清晰平整,计数区域做过特殊亲水处理,但是长期使用,液体扩散能力也会明显降低,细胞分布均匀性也会下降。国产计数板在刻度的准确性和材料的表面处理上,较进口计数板仍有差距。

  计数板的计数总体积在0.4μL,占加样量10μL的比例较小,因此样本均匀分布和计数空间的定量就显得格外重要。

  目前市面上带计数板耗材的细胞计数仪的核心技术路线,是省略了装片和显微镜检步骤,各类计数仪上样体积有多有少,有10μL、20μL以及其他体积量。样本量的多少与计数板耗材的面积和厚度有关,而最终计数时的定量,是由视野大小和计数板厚度相乘所决定。为了保证计数定量本身的稳定性,对计数板加工厚度以及内表面的亲水处理要求的一致性较高。

  另外,一些全自动细胞计数仪和流式细胞仪的计数定量,通常是由高精度的柱塞泵完成。此类定量方式,需要定期校准,长时间工作会带来精度上的变化。而且在使用过程中,气泡的干扰往往也会导致结果不稳定。

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