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测定蛋白含量有什么方法(附带步骤)

2022-11-08 10:34:10
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  蛋白的含量的测定方法主要有紫外分光光度法、Lowry法、BCA法等。

  紫外分光光度法

  原理

  蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环在275~280mm有一紫外吸收峰。在一定浓度范围内,其在280mm的吸光度与蛋白浓度成正比。

  方法

  取适量蛋白溶液(约3.5ml),置于光径为1cm的石英比色杯、用与溶解蛋白的缓冲液相同的缓冲液为对照,在280mm波长处测定吸光度,吸光度为1.0的蛋白溶液,蛋白浓度约为1.0mg/ml。当溶液中含少量核酸时,应同时测定260nm波长处的吸光度,以下式估算蛋白浓度:蛋白浓度(mg/ml)=1.55A280-0.75A260。该测定方法误差较大,有紫外光吸收的物质(如核酸)干扰大。

  材料和仪器

  (1)4%Na₂CO3;(2)0.2mol/LNaOH;(3)1%CuSO4;(4)2%酒石酸钠。试剂A:使用前,将(1)(2)(3)(4)试剂以50:50:1:1的比例混合均匀,当天使用。试剂B:酚试剂。

  Lorry法

  Lowry法灵敏度较高,线性范围为20~100ug/ml。该方法干扰因素主要有:高浓度的胍盐、尿素等变性剂,Triton、Tween等去垢剂,EIDTA等整合剂,以及Tris、甘氨酸等等。

  材料和仪器

  材料:(1)4%Na₂CO3;(2)0.2mol/LNaOH;(3)1%CuSO4;(4)2%酒石酸钠。试剂A:使用前,将(1)(2)(3)(4)试剂以50:50:1:1的比例混合均匀,当天使用。试剂B:酚试剂。

  仪器:分光光度计。

  操作步骤

  (1)准确称取10mg标准蛋白(常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白)加蒸馏水溶解定容至100ml。

  (2)取6支试管分别编为0~5号,分别加入步骤(1)制备的标准蛋白溶液0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40ml,并都用蒸馏水补足至0.4ml。

  (3)各试管加入试剂A 2ml,混匀,室温放置10分钟。

  (4)各试管加入试剂B 0.2ml,立即混匀,室温或37℃水浴中,保温30分钟。

  (5)在分光光度计上,以0号为参比,测定各管样品在750mm的吸光度值。

  (6)以蛋白浓度为横座标,吸光度为纵座标绘制标准曲线,或作直线回归。

  (7)取样品溶液0.4ml,按步骤(1)~(5)测定,将测得的吸光度值代入上述标准曲线,计算蛋白浓度。

  注意:如果样品浓度过高,可用蒸馏水作适当稀释。

  BCA法

  BCA法的优点是抗干扰能力强,其原理是:在碱性溶液中,蛋白将二价铜还原成一价铜,后者与试剂中的BCA(二辛可酸,Bicinchoninic acid)形成一个在562mm处具有最大吸光度的紫色复合物,其吸光度与蛋白浓度成正比,线性范围20~100ug/ml。

  材料和仪器

  试剂A:1%BCA二钠盐,2%碳酸钠,0.16%酒石酸钠,0.4%氢氧化钠和0.95%碳酸氢钠。用50%NaOH或碳酸氢钠调pH11.25。

  试剂B:4%硫酸铜

  工作液:100倍体积试剂A与2倍体积试剂B混合。

  操作步骤

  (1)准确称取10mg标准蛋白(常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白)加蒸馏水溶解定容至100ml。

  (2)取6支试管分别编为0~5号,分别加入步骤1制备的标准蛋白溶液0、20、40、60、80、100 ul,并都用蒸馏水补足至100ul。

  (3)各试管加入工作液2ml,混匀,37℃水浴保温30分钟。

  (4)在分光光度计上,以0号为参比,测定各管样品在562mm的吸光度值。

  (5)以蛋白浓度为横座标,吸光度为纵座标绘制标准曲线,或作直线回归:

  (6)取样品溶液100 ul,按步骤1~4测定,将测得的吸光度值代入上述标准曲线,计算蛋白浓度。

  注意:如果样品浓度过高,可用蒸馏水作适当稀释。

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