软琼脂克隆形成又名非锚定依赖性生长实验Anchorage-independent assay，利用软琼脂为培养介质，使细胞在悬浮状态下生长。
某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，进而通过软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。
1. 具体过程：如下图所示
1.配制1.2% 和0.7%琼脂，高压灭菌后，维持在42℃中使其不会凝固；
2.将1.2% 琼脂与2×培养基混合，铺入6孔板作为下层胶，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；
3.将制备好的单细胞悬液与0.7%琼脂充分混匀，加入6孔板作为上层胶，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培养基，每3天更换一次；
4.根据细胞的生长速度培养2~3周后显微镜下观察克隆大小，与平板克隆一样，每个克隆>50个细胞，显微镜拍照。若拍整个孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色，37°C过夜，拍照。
2. 数据分析：显微镜或相机拍照，计算克隆形成率
例：通过软琼脂克隆形成实验检测ME2蛋白对神经胶质瘤细胞生长的影响。在神经胶质瘤细胞GBM8401中将ME2蛋白敲低，形成的克隆数减少。
注意事项
1.上层软琼脂使细胞分散成单个，下层软琼脂作为支撑防止细胞贴附生长。最后铺上一层培养基是为了防止胶干燥，并给细胞补充营养，如果做药物处理，则在培养基中加入药物。
2.上层胶细胞数目根据不同的细胞类型而定。一般以5000个细胞/孔作为起始浓度，根据需要调整。
3.琼脂放入水浴锅中维持在42℃左右。温度过低琼脂凝固，在做基底时琼脂凝固过快会导致不均一，温度过高则会将细胞烫死。此外，实验过程中速度要快，防止局部结块。
