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软琼脂克隆形成实验操作过程

2022-10-24 10:24:47
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  软琼脂克隆形成又名非锚定依赖性生长实验Anchorage-independent assay,利用软琼脂为培养介质,使细胞在悬浮状态下生长。

  某些恶性肿瘤细胞,不仅在贴壁状态下能增殖,在悬浮状态下也能增殖,进而通过软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度,可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。

  1. 具体过程:如下图所示  

操作步骤

  1.配制1.2% 和0.7%琼脂,高压灭菌后,维持在42℃中使其不会凝固;

  2.将1.2% 琼脂与2×培养基混合,铺入6孔板作为下层胶,每孔1.5ml,37°C孵育30 min使之凝固;

  3.将制备好的单细胞悬液与0.7%琼脂充分混匀,加入6孔板作为上层胶,每孔1.5ml。待其凝固后,再在上面加入培养基,每3天更换一次;

  4.根据细胞的生长速度培养2~3周后显微镜下观察克隆大小,与平板克隆一样,每个克隆>50个细胞,显微镜拍照。若拍整个孔,每孔加入200μl氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色,37°C过夜,拍照。

  2. 数据分析:显微镜或相机拍照,计算克隆形成率

  例:通过软琼脂克隆形成实验检测ME2蛋白对神经胶质瘤细胞生长的影响。在神经胶质瘤细胞GBM8401中将ME2蛋白敲低,形成的克隆数减少。

图例

  注意事项

  1.上层软琼脂使细胞分散成单个,下层软琼脂作为支撑防止细胞贴附生长。最后铺上一层培养基是为了防止胶干燥,并给细胞补充营养,如果做药物处理,则在培养基中加入药物。

  2.上层胶细胞数目根据不同的细胞类型而定。一般以5000个细胞/孔作为起始浓度,根据需要调整。

  3.琼脂放入水浴锅中维持在42℃左右。温度过低琼脂凝固,在做基底时琼脂凝固过快会导致不均一,温度过高则会将细胞烫死。此外,实验过程中速度要快,防止局部结块。


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