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常用的蛋白定量方法有哪些(几种常用的定量方法)

2022-10-24 10:29:51
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  蛋白质作为生命活动的物质基础之一,也是生命活动的主要承担者,是科研工作中的重要研究对象。而在这些精细化研究工作中,蛋白定量是蛋白分离和分析前必须的一个重要步骤,蛋白色谱分离、蛋白质电泳分析、蛋白质免疫分离和分析、细胞裂解释放的总蛋白定量、蛋白分子的标记、蛋白结构分析等,都需要可靠的定量分析作为基础。依托不同的科学原理,目前已经发展出多种不同的蛋白测定方法,其中BCA法、Bradford法和紫外法在科研实验中应用最为广泛。

  下面我们介绍几种常用的定量方法:

  比色法

  通常蛋白定量使用的方法是比色法,通常用于总蛋白的定量分析。根据蛋白和比色试剂的结合,可以将比色法分为:蛋白-染料结合法和蛋白-铜螯合化学试剂法。前者对应的典型蛋白定量比色法是Bradford法,后者则包括双缩脲法,Lowry法,BCA法。

  Bradford法

  Bradford法也叫作考马斯亮蓝法,是由Marion Bardford博士在1976年首次提出,原理是蛋白在酸性条件下和考马斯亮蓝G250结合,通过范德华力与蛋白质的碱性基团结合形成稳定的染料-蛋白复合物,并且在595nm处有最大的吸收差异。结合到蛋白质分子上的染料数与蛋白所带正电荷成正比,因此可以用该方法来对蛋白进行定量。染料的颜色变化和蛋白中的碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)有关,另外范德华力和疏水作用也会影响蛋白与染料的结合。

  BCA法

  1985年Paul K. Smith等人开发出BCA (Bicinchoninic acid)方法,该方法分为两步:首先,在碱性条件下,蛋白将二价铜离子还原为一价铜离子,然后,BCA和一价铜离子结合,形成紫色复合物,该复合物在562nm时有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。

  紫外分光光度法

  紫外法也是常用的蛋白定量方法之一,该方法在简单的分光光度计中就可以定量测定溶液中蛋白质的含量。蛋白质对近紫外光的吸收依赖于酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)含量,同时在很小的程度上也会受到苯丙氨酸(Phe)和二硫键数量的影响。在280nm波长内吸收峰的光密度值与其含量成线性关系。通过分光光度计检测靶标蛋白280nm波长,即可根据Beer-Lambert定律换算出靶标蛋白的浓度。

  大家可以根据以上介绍,选择合适自己的方法,对蛋白进行定量分析。

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