您的位置:首页>>公司动态>>行业资讯

常见的细胞消化方法有哪些

发布时间:2022-10-24 10:34:42 阅读:11702次 来源:百度学术

网上关于“常见的细胞消化方法有哪些”的话题热度比较高,小编也是特意寻找了一些与之相关的一些信息来分享给大家,希望能够帮助到您。

  机械消化法

  直接用液体吹打或用刮刀,施予外力让细胞与培养底物分离;适用于贴壁性弱的细胞传代,但相较于其它消化方法,这种外力无法量化控制,细胞分散效果差,且可能会造成大量细胞破损,使内容物释放到培养基,进而影响细胞传代状态。

  离子螯合法

  细胞膜表面蛋白大多需要钙、镁离子来维持与胞外基质的稳定键结,当然也包含各种黏附蛋白(例:整合素、钙黏着蛋白、桥粒等),螯合剂会在不破坏细胞膜表面蛋白的状况下,抽离这些离子,使黏附蛋白失活而减少细胞-细胞间及细胞-底物间的连接作用,让细胞较容易在施予外力时,脱离培养底物并促进细胞分散。

  0.02% EDTA是细胞传代最常用的离子螯合剂,在37℃作用效果最佳(消化较敏感的细胞可在4℃作用),适用于消化一般贴壁性细胞或细胞表面标记实验细胞。

  但EDTA无法用血清终止其反应,所以在消化细胞后必须用缓冲盐溶液(如:PBS)清洗离心,以免影响后续细胞贴盘效果。

  酶消化法

  用蛋白水解酶消化连接细胞及培养底物的蛋白质,适用于消化贴壁性稍强的细胞。

  上述实验方法中最常见的还是胰酶消化。大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可,但是我们发现吸去胰蛋白酶后,残留的那些附着在细胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2分钟足够消化细胞(绝大部分1分钟不到)。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞,连续这样传代,对细胞伤害很大。简单的程序是先采用PBS润洗细胞吸去,胰酶润洗吸去,然后37度消化细胞。

  所谓消化并不是细胞全部分散分布形成单个圆形才算消化完好,一般我们肉眼观察贴壁细胞表层,只要能漂浮移动了,多半呈沙粒状漂浮移动,其实已经可以了。说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了,细胞之间的附着也已经消失了,细胞已经独立分布了(虽然没有呈现很广的离散分布)。这个时候应该停止消化,不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好,间隙很大,才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液,之后在贴壁的过程中仍然会聚集,这个是贴壁培养的细胞,尤其是肿瘤细胞的一个特性。

  细胞只要能从基质上脱离下来,这个时候即使是成片的(比如Calu-3细胞),吹打不超过20次后(一般10次即可),成小规模聚集(10个细胞左右),是正常的,不要试图再去延长消化时间。不要以为成片分布是自己没养好,这个视细胞而定。如果和标准形态不一致,那可能是自己没消化好导致的,但如果消化方法正确,仍然成片分布,甚至完全吹打成单细胞悬液,贴壁后仍然成片分布,这是细胞的特性,是因为贴壁过程中重新聚集了。

  如果遇到比较难消化的细胞(润洗方法5min还不能消化),就以colon cancer为例,比如HCT15, LS411和KM12,这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育,但也不需要很多,一般100 mm dish,一次最多加入500ul,就足够了。即使这样难消化的细胞,一般不超过5min,即可见细胞成片移动,就应该停止消化。一些正常细胞也会有难消化的时候,比如tsDC细胞,但也只要用少量胰酶孵育,3min左右即可看到成片沙状移动。

  针对消化时间和细胞类型、消化液的消化能力、细胞的密度等多种因素有关。一般养一种新的细胞要摸索一下消化时间,掌握细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强,配好后可分装成小管,一次用完,其余冻在-20℃,以保持酶活力。细胞生长到覆盖70~80%瓶底时消化较好,若细胞密度过大则消化后细胞易成团。

  我们常规的细胞实验(增殖,凋亡,迁移,分化之类的),如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化的话(难消化细胞例外),受消化影响不是很大。但少数实验,比如病毒包装,对细胞代数,对细胞状态要求极高。这个时候,胰酶消化,就是润洗,都会对细胞包装病毒的能力有影响,传代次数一多,细胞包装能力就会逐渐下降(当然也有其它因素影响包装效率)。这个时候都不用胰酶消化,用一些盐溶液(不是EDTA液)即可。这些盐溶液通过影响ECM相关酶的活性,来使得细胞脱离基质附着表面,但不切割任何蛋白。

  吸去胰酶后,残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足够消化细胞(绝大部分1min不到)。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞,连续这样传代,对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去,胰酶润洗吸去,然后37℃消化。比较难消化的细胞(润洗方法5min还不能消化),这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育。


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1706.html

注释:[本文仅供阅读]不代表企业及作者的立场,如侵权请联系删除,欢迎分享本文,转载请保留出处!

推荐服务

  • 分子实验

    分子实验平台为广大科研工作提供蛋白、RNA和DNA分子类分析及检测服务···

  • 细胞实验

    细胞实验平台为广大科研工作者提供原代细胞提取、鉴定和培养相关服务···

  • 病理实验

    动物实验平台为广大科研工作者提供动物寄养、疾病模型构建和体内验证···

  • 动物实验

    动物实验平台为广大科研工作者提供科研成果向产品转化的服务,转化方···

  • 精准医疗

    精准医疗平台为癌症患者提供肿瘤移植动物体内服务,模拟患者癌症发展···