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细胞克隆实验基本原理及方法(附带注意事项)

发布时间:2022-10-20 10:25:42 阅读:13012次 来源:百度学术

  细胞克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法,常用于抗肿瘤药物敏感性测定、基因治疗、肿瘤放射生物学等方面的研究。细胞克隆形成实验的常用方法有平板克隆形成和软琼脂克隆形成两种。

细胞克隆实验基本原理及方法

  当单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞,大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。克隆形成率反映细胞两个重要性状:细胞群体依赖性、增殖能力。由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大:

  a).初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强;

  b).二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强;

  c).正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强。

  实验方法

  1.平板集落形成实验:本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞。

  注:适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。

  2.软琼脂集落形成实验:本法适用于非锚着依赖性生长的细胞,如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。

  注:正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验。

  细胞克隆形成实验的注意事项:

  1. 实验成功的关键之一是细胞悬液的制备与接种密度,细胞一定要分散均匀,不能有细胞团,接种密度不能过大。

  2. 接种完毕后,需将培养基置于37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2~3周,期间需每隔3 d换一次液,换液过程需缓慢加入培养基,避免将细胞吹起。

  3. 当肉眼可观察到培养皿中出现克隆后终止培养,弃上清,用PBS小心冲洗2~3次,而后固定15 min、结晶紫染色20 min,洗去染色液后观察计数,克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

  4. 在软琼脂克隆形成实验中,需配置下层软琼脂和上层软琼脂,前者是为防止细胞贴附生长,后者是作为营养补充剂以及为防止下层琼脂胶干燥。

  5. 软琼脂与细胞液混合时温度不宜超过40℃,否则将会烫伤/死细胞。

  6. 琼脂经灭菌后应分装备用,反复加热易导致琼脂降解而产生毒性,且其硬度也会有所下降。

  7. 不同细胞的生长能力有所差异,若细胞克隆率过低,可在培养基中添加胰岛素等促克隆形成物质。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1692.html

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