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如何做好细胞克隆形成率实验

发布时间:2022-10-20 10:28:37 阅读:1992次 来源:百度学术

  细胞克隆形成率即细胞接种存活率,表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆,而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

  克隆形成的目的

  1. 评价不同杀伤因素(药物、基因等)对肿瘤细胞增殖能力或群体依赖性的敏感性;

  2. 评价细胞在体内成瘤性,癌细胞不一定都可以在体内成瘤,但若体外克隆能力越强,即表明体内成瘤性越强,算是一种模拟体内成瘤的体外实验。

  细胞克隆流程

  1 取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在完全培养基中备用;

  2 将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每孔50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含2mL 37℃预温培养液的六孔板中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2~3周;

  3 经常观察,当培养板中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞1mL固定15分钟。然后去固定液,加适量GIMSA应用染色液染10~30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥;

  4 将平皿倒置白色纸片上,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

  克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)×100%。

  细胞密度为多少合适?

  细胞接种密度与最终实验结果密切相关,若细胞太多,形成克隆数目太多,很难拍到单独的克隆团。而细胞太少,可能无法形成克隆,从而影响对该细胞增殖能力的判断。一般来说,正常增殖速度为1:5-1:10传代,3天长满细胞,可以接种500个细胞,其余增殖缓慢细胞,可以接种800-1000。

  细胞接种后培养的时间,如何确定?

  通常情况下,单个细胞在体外增殖6代以上所组成的细胞群称为一个阳性克隆,时间约为一周;但具体时间因细胞增殖能力而已异,因此应密切关注细胞生长情况,隔天在显微镜下观察克隆情况,若单个克隆细胞数到达50个左右即可固定细胞。

  细胞铺板均匀的重要性

  若铺板不均匀,细胞稀的地方形成的克隆少,而密的地方克隆多,一方面影响统计结果,并且拍出的图片不美观。

  细胞未形成克隆的原因?

  并非每种细胞都可以形成克隆,克隆形成率与细胞本身增殖能力有关。还与接种细胞密度,加入培养液的体积、血清浓度有关。因该实验处理时间较长,应给细胞多加培养基,如每孔4ml,或者3天更换一次培养基,以供给细胞充足的营养。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1693.html

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