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克隆形成实验方法原理与步骤解析

2022-10-20 10:36:33
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  克隆形成实验是测定细胞增殖能力的有效方法之一,贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆,而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。细胞克隆形成率表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量,可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。通过观察单细胞集落形成情况,来计算克隆形成率,了解其增殖能力。

  其技术原理:单个细胞在体外持续增殖6代以上时细胞数量已达60个左右,此细胞群体成为克隆或集落,大小在1.0-2.0 mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力,各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变,通过计数克隆形成率,可对单个细胞的增殖潜力做定量分析,了解细胞的增殖率和对生存环境的适应性。软琼脂培养或平板克隆是最常用的方法。

  平板克隆形成(Colony Formation):细胞培养在培养基中,应用于贴壁的细胞。

  实验步骤

  Step1:细胞培养,调整细胞状态

  Step2:制备单细胞悬液

  Step3:按不同的细胞浓度梯度把细胞均匀接种于培养平板

  Step4:培养一段时间

  Step5:观察克隆情况,固定染色后计算克隆形成率

  软琼脂克隆形成(Soft Agar Colony Formation):利用软琼脂为培养介质,使细胞在悬浮状态下生长。

  实验步骤

  克隆形成实验需要注意的几个点:

  1、对数生长期,细胞状态良好的情况下,0.25%胰酶消化,离心后重悬时一定要吹打成单细胞悬液。可以选择6孔板作为克隆培养板,按密度梯度(如100、200、300)接种进孔板中。接种后切记晃动平板,使细胞分布均匀。

  2、培养2周左右(出现肉眼可见细胞集落时),即可固定染色。加固定液和染色液时,覆盖住孔板底层即可。但如果长时间不处理,需增加液体量,防止液体干涸,影响拍照效果。

  3、拍照时,务必使每个孔中无阴影,如无法达到,则逐个孔进行拍照。

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