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细胞培养实验流程及注意事项(细胞培养基本知识分享)

发布时间:2022-10-20 10:46:00 阅读:11612次 来源:百度学术

  一、无菌

  无菌的操作要**细胞培养中的头等大事,从培养基到操作过程再到培养箱,不管哪一环节忽视了无菌的原则,细胞的损失必将惨重,甚至有可能全军覆没。

  1.超净台

  超净台可以看做是一个微型的无菌室,做好维护工作,就能提供一个不错的无菌环境。在使用之前和之后,用70%-75%酒精棉,反复擦洗台面。如果超净台处于人流较大的环境。在开启超净台之前可在周围喷70%-75%酒精。除此之外,也可用紫外灯**:经常用的超净台开15分钟便可,不经常使用的超净台开半小时。

  2、酒精灯

  酒精灯的高温灼烧可以消灭大多数的微生物,在操作过程中,玻璃制具(如移液管,玻璃管、10 ml移液枪头等)都要注意在酒精灯上灼烧十多秒,等待冷却再使用。而对于塑料一类的材料(如瓶塞等),也要在酒精灯前面过一下。

  3、试剂

  细胞培养中所用到一切试剂(如培养液、生长因子、抗性试剂、筛选的**等),都有遭受微生物污染的可能性,而试剂染菌是很大一部分染菌现象的根源。因而,使用试剂前好验菌,哪怕是**产品,用前也要验菌,用完还需拿封口膜将其封口。另外,试剂在冰箱放久了,再次使用前也要验菌。在这些小细节上多花一些时间,便可换来我们的安心。

  4、个人卫生

  实验者的个人卫生情况对细胞培养成功与否也有很大的关系,比如隔离服、手套、口罩等清洁装备,可以防止自带的污染菌接触细胞。东西要进入超净台,可以用酒精棉擦拭以**。记住,要避免未经****的东西与细胞相接触!

  二、培养条件的品质

  上等的硬件设施、培养试剂和实验耗材很大程度上可以细胞培养的顺利进行,实验室如果有条件的话,所有的东西都尽量使用好的,比如:

  1.硬件设施:好的超净台和生物安全柜等。

  2.培养试剂:培养基、血清、胰酶、生长因子、抗性试剂、筛选的**等尽量使用进口产品;

  3.实验耗材:培养皿、移液枪、枪头等也尽量使用进口产品。

  三、操作习惯

  1.自己准备一套个人的实验器具,不要和别人混用。

  2.不管是买的细胞、还是惠赠的细胞,刚拿到手赶紧的做两件事:

  ① 检测是否有支原体污染;

  ② 迅速扩增冻存。

  3.发现细胞有污染的迹象就迅速处理掉:**污染和**污染很容易发现,而支原体污染后,细胞会长的慢,买个支原体检测的kit定期检测一下。

  4.别怕浪费,像枪头之类的实验耗材,只要有可能污染就立即更换。

  5.近换了什么新的东西稍微记一下,试剂一旦怀疑污染,马上丢。

  6.实验时所用材料的位置摆放要顺手,污染源和已**物品要分开放置。

  7.动作要快,胰酶消化,换液等,细胞暴露在空气中的时间越少越好。

  8.吹的时候,动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡,动作太轻就吹不下来。吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来,留一点,枪的头部尽量深的在液面以下。

  9.对于娇弱的细胞,要更细心呵护:胰酶消化不能过久,吹得时候要轻柔,离心时候也要注意转速和时间,每天都要去看一下细胞——肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。

  10.离开过操作台的东西再进操作台之前要用酒精喷一遍,包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。

  11.使用酒精灯时,别直接放到火上,离一段距离。

  12.身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方,比如实验台和培养箱内部等。

  13.实验结束后对实验台的**、和细胞房日常的值日清洁是的,此外还要定期熏蒸。

  14.培养箱隔一段时间用酒精棉擦洗一次。

  四.细胞传代、冻存和复苏

  细胞传代是细胞培养比较重要的一环,传代的好坏会影响细胞的生长状态(传代时机、传代时间长短、传代手法);而细胞冻存和复苏重要的就是慢冻速融。

  1.一般细胞汇合度达到70%就可以进行传代。如果想要细胞状态更好,可以在汇合度50%左右就进行传代。当然接种的时候也相应的减少数量,保持细胞生长周期在三天以上(传代太频繁,细胞状态很差)。

  2.传代时细胞数量不可以太稀,传的稀的细胞会长的特别慢;细胞密度也不能太大,到时候培养基营养不够,出现凋亡细胞。

  3.细胞的传代要规律,保持相同的频率和传代时间间隔,不要随心所欲或者拖延。

  4.有时间的话,需要细胞计数:传相应数目的细胞到培养皿中,可以大致清楚细胞的生长曲线,不会临时要处理,手足无措。

  5.不同细胞生长周期不同:有的生长很快(比如MDA-MB-231),传代时取离心悬液的十分之一就已经足够了;有的生长很慢(比如BT474),传代是一分二,复苏起始的时候两周多才能长满,所以要在培养细胞的过程中多多摸索。

  6.细胞冻存前**习惯换液:通常是细胞传代两天后换液,然后第三天冻存细胞,主要是让细胞保持对数生长状态。

  7.冻存液:冻存液好现用现配。

  8.冻存盒:冻存盒用完好放在室温中。很多同学用完冻存盒后,直接将其放到-80℃,下次冻存细胞接着用。这时候冻存盒本身已经接近-80℃,里面的异丙醇已经不能起到缓慢降温的作用了。

  9.冻存细胞复苏后**天好更换一次培养基。

  10.每次开展相关实验的时候(**筛选等),铺板和冻存一起做,就是铺板的细胞同时冻存一批,如果实验结果不错,后期可以马上复苏出来重复实验。

  五、其他注意事项

  1.培养基的配制要做好梯度摸索并详细记录,否则细胞都不知道是怎么死的。

  2.细胞房不能进去太多人,避免相互干扰。

  3.尽量提高操作熟练度,减少培养皿在培养箱外的滞留时间,细胞很脆弱,经不起折腾。

  4.把握好培养基更换的时间,不同细胞类型时间不同,早了浪费试剂,晚了可能全军覆没。

  5.要做什么心里要非常清楚,合理安排时间,细胞房的实验穿**行,可以节省很多时间,也不会耽误别人的实验。

  6.养细胞大的教训:不能偷懒!


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