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细胞培养如何消毒灭菌避免污染

发布时间:2023-03-20 10:36:25 阅读:15662次 来源:百度学术

  细胞培养最大的危险是发生培养物的细菌、真菌和病青等微生物的污染,为更好地保证无菌间内细胞培养处于一个良性的操作环境,在此特地整理了关于在细胞培养过程中如何消毒灭菌及有效避免污染,供科研小伙伴参考。

  要控制污染问题的出现就要对可能引起污染的因素以及实验室常规灭菌与消毒的措施有所认识污染主要是由于操作者的疏忽而引起,常见的原因有操作间或周周空间的不洁,境养皿和培养液消毒不合格或不彻底。由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败,故细胞培养的每个环节都应严格遵守无菌操作规范,防止发生污染。

  细胞培养对无菌环境的要求较为严格。微生物污染通常是造成细胞培养失败的主要原因,细胞间的杀菌主要涉及空气的杀菌,常见消毒方法分为三类:物理灭菌法(紫外线、湿热、干烤、过滤等),化学灭菌法(各种化学消毒剂)和抗生素。

  常见消毒方法

  1.物理灭菌法

  1.1紫外线消毒

  紫外线是一种低能量的电磁辐射,可杀死多种微失物。革兰阻性菌最为敏感。其次是阳性菌。再次为芽孢、真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破环微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活,间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒,用法简单,效果好。

  紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关,辐射强度随灯距离 增加而降低,照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2米的30W灯可照射9平方米房间,每天照射2-3小时,期间可间隔30分钟。灯管离地面2米以外要延长照射时间,2.5 米照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米,照射时间30分钟为宜。由于上述各种情况的不确定性,导致紫外线杀菌效果不是很理想,一般般需要过夜杀菌。此外紫外线对人体有伤害作用,紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害,且对培养细胞与试剂等也产生不良影响,因此不要在紫外线灯照射下进行操作。

  1.2高温湿热灭菌

  压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力,能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。

  不同压力蒸汽所达到的温度不同,不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品(不包括液体),应立即放到60-70℃烤箱内烘干,再贮存备用,否则,潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法,它具有条件简单、使用方便等特点。

  1.3高温干热消毒

  干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上,并保持90-120分钟,杀死细菌和芽孢,达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿(如体积较大的烧杯、培养瓶)、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品(如粉剂、油剂)。

  干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开,切忌立即打开,以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙,物品不要靠近加热装置。

  烧灼也是灭菌方法之一,常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。

  1.4过滤除菌

  是将液体或气体用微孔薄膜过滤,使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留,从而达到除菌目的。在体外培养时,过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前,大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。

  2.化学消毒法

  最常见的是75%酒精及1%的新洁而灭。

  75%酒精消毒的原理是通过使细菌或真菌表面的蛋白脱水,变性凝固,最终杀死细菌,主要用于操作者的皮肤、操作台表面及无菌室内的壁面处理。

  1%新洁而灭的杀菌原理为:①改变细胞的渗透性,使细菌破裂;②使蛋白质变性;③抑制细菌体内某些酶,使之失去活性;④因其有良好的表面活性,可高浓度聚集于菌体表面,影响细胞的新陈代谢。新洁尔灭对化脓性细菌、肠道菌及部分病毒有一定的杀灭能力;对结核杆菌、真菌的杀灭效果不好;对细菌芽胞仅能起抑制作用。

  3.抗生素消毒

  抗生素主要用于消毒培养液,是培养过程中预防微生物污染的重要手段,也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同,应根据需要选择。

  可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多,但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气;多用新洁而灭消毒实验室地面;常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿;采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。

  细胞培养过程中环境污染是如何发生

  1.取放细胞时引起的污染

  细胞培养过程中,取放细胞是最基本的操作,培养房开关门的瞬间,环境中的微生物或多或少会进入培养箱中,而且内外温差导致内门冷凝水的产生,极易吸附微生物,都是造成培养箱污染的风险因素。

  2.灭菌不彻底造成的二次污染

  细胞培养过程中,因其它操作问题(如培养基泼洒,水盘污染等),造成培养房的大规模污染也时常会发生, 此时就需要对培养箱进行灭菌消毒,常规的消毒(如紫外照射)只能达到表面消毒的效果,特别是对真菌等顽固性污染,无法进行彻底灭菌,导致后续培养过程中细胞污染频发。

  如何有效避免污染

  1.重视细胞房管理工作,规范操作

  定期进行细胞房清洁消毒工作,规范实验人员操作(如身着白大褂、换鞋等),创造洁净培养环境。

  2.避免频繁查看细胞

  做好实验规划,减少培养箱门开关的频率,取放细胞时需佩戴洁净的手套,并用少量的70%医用酒精(过多会导致培养箱中残留乙醇蒸汽)擦拭培养瓶/皿表面,从而降低细胞培养箱污染的风险。

  3.定期维护和灭菌,预防污染

  定期清洁维护,培养箱内用水灭菌后使用并定期更换,选择培养箱时,可优先考虑有自动灭菌功能的培养箱。细胞房一旦发生污染,及时进行消毒灭菌工作。

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