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流式细胞术在免疫学中的应用

发布时间:2022-05-13 10:27:11 阅读:1302次 来源:流式细胞术

  流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是二十世纪70年代发展起来的,是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型技术,能够对处在快速直线流动状态中的细胞或微球进行多参数的、快速的定量分析和分选,且能保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏。通过荧光探针的协助,它不但可以定量检测细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成份,而且可以研究细胞的各种功能状态,如细胞增殖、细胞凋亡等,广泛应用于科研和临床。本文仅对FCM在免疫学中的应用做一简要综述。

  1、流式细胞术原理

  流式细胞仪的基本工作原理是采用激光作为激发光源,利用荧光染料与单克隆抗体结合的标记技术,通过计算机系统对流动的单个细胞或微粒的多个参数信号进行数据资料处理,从而对目的细胞或微粒进行详细的分析。FCM常用的荧光染料有FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)、PI(碘化丙啶)等,常用的标记方法为直接免疫荧光染色和间接免疫荧光染色,采用的是抗原抗体特异性结合的原理。直接免疫荧光法多用于对细胞表面标志的染色分析,选用单克隆荧光抗体,直接与相应抗原反应。每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体,特异性高,缺点是敏感性偏低。间接免疫荧光法是选用特异性单抗(一抗)与待测细胞结合后,再用荧光二抗(针对一抗的特异性抗体)进行标记染色,形成抗原-抗体-荧光抗体复合物后上机检测分析。此法应用广泛,最适宜检测一些新的未知抗原,进行一些研究分析。这种方法只要标记几类种属特异性不相同的二抗即可。由于流式细胞仪及软件系统的飞速发展,为了获取双参数或多参数数据资料,需要进行荧光抗体的组合标记,常采用二色、三色、四色甚至更多标记。

  2、FCM在免疫学中的应用

  随着单克隆抗体技术、荧光色素化学等技术的发展,正像免疫学作为一种不断发展的学科和技术手段延伸到生物、医学及其他领域一样,流式细胞术也以它的快速、灵活和定量的特点,广泛地被应用于免疫学理论研究和临床实践的各方面,包括淋巴细胞及其亚群测定、淋巴细胞功能检测、白血病免疫分型、移植免疫和自身免疫性疾病相关HLA抗原分析中的应用等。

  2.1 淋巴细胞及其亚群测定

  FCM通过检测淋巴细胞表面抗原,可以将不同的淋巴细胞亚群区分开,计算它们之间的比例,甚至可以绝对计数。经常测定的淋巴细胞亚群包括T淋巴细胞(CD3+),T辅助细胞(CD3+、CD4+、CD8-),T抑制细胞(CD3+、CD4-、CD8+),B淋巴细胞(CD19+或CD20+),NK细胞(CD3-、CD16+、CD56+)等。通过检测淋巴细胞表面标志,可了解在不同情况下机体的免疫功能状态,辅助诊断疾病,指导临床治疗。Fumihito Yoshii等[1]对18例吉兰-巴雷综合征(GBS)患者发病初期血液进行检测则发现,CD3+、CD4+和CD4+、CD45、RA+T细胞较健康对照组增加,经过血浆置换治疗后,这种淋巴细胞亚群的改变趋于正常。正常状态下CD4+/CD8+一般为2/1,但是当患有类风湿性关节炎等自身免疫性疾病时,使用FCM检测二者的比值就会升高[2];当患有艾滋病或者其它肿瘤时,使用FCM检测二者的比值就会下降[3]。淋巴细胞亚群的绝对计数可用于疾病的诊断和治疗中,如艾滋病患者的血液中CD4+T细胞<200个/μl,而仅有HIV感染而未发病者,则CD4+T细胞>200个/μl,淋巴细胞亚群的绝对计数是实验室检测发展的趋势。FCM与传统的免疫荧光抗体染色后再用荧光显微镜观察,或用细胞免疫组化方法染色后用普通显微镜观察100-200个细胞相比,其结果更为真实和客观,更具有指导意义。

  2.2 淋巴细胞功能分析

  淋巴细胞表面抗原的检测不能完全了解淋巴细胞的功能,需要对细胞内细胞因子或体外培养细胞后进行相关指标测定。检测细胞因子的方法有酶连免疫斑点法、有限稀释分析法、RT-PCR法、原位免疫组化法、ElISA法等。每种方法都有自己的特点,但相比较,FCM更有优势。FCM不仅可检测细胞群中单个细胞分泌的特有或共表达的不同因子,确定产生细胞因子的阳性细胞的百分率,而且可同时确定阳性细胞的表型,是一种可以在单细胞水平研究细胞因子的有效方法[4]。FCM可在同一细胞内同时检测两种不同的细胞因子,也可用多参数流式细胞术对胞内多种细胞因子进行测定。目前,在临床上利用FCM检测细胞内细胞因子(Intracellular Cytokine,ICK)来反映淋巴细胞的免疫功能,尤其是T细胞的功能。例如HIV选择性地作用于宿主的CD4+T细胞,使之大量耗竭,用FCM检测CD4+T细胞产生的细胞因子可间接反映CD4+T细胞的免疫功能。传统的形态法、氚标胸腺嘧啶核苷(3H-TDR)掺入法、MTT比色法等均不能反映不同T细胞亚群的增殖状态,而用活细胞染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记淋巴细胞,结合流式细胞术可有效检测出不同T细胞亚群对不同刺激剂的增殖反应以及增殖动力学变化[5]。范艳莹等[6]用CFSE标记结合流式细胞术研究人外周血NK细胞分裂、增殖和杀伤功能。金齐力等[7]用流式细胞术检测人γδT细胞对MTB感染THP-1细胞的细胞毒活性,并观察Il-15对人γδT细胞杀伤MTB感染THP-1细胞的细胞毒活性的影响。

  2.3 白血病免疫分型

  白血病长期以来主要通过骨髓细胞形态学和细胞组织化学进行诊断,在很大程度上依赖于检验者的经验,主观性明显。FCM免疫分型是从造血细胞克隆进化过程中分化抗原表达的角度来认识白血病细胞克隆的特点及分化阶段,多参数分析白血病细胞的细胞膜、细胞浆或细胞核的抗原表达。各种血细胞系统都有其独特的标志,当形态学检查难以区别时,免疫分型参数对各种白血病的诊断和鉴别诊断有决定作用。例如干细胞表达CD34,髓系表达CD13及MPO,B细胞系表达CD10、CD19、CD20等,T细胞系表达CD2、CD3、CD5、CD7。采用CD45/侧散射(SSC)双参数散点图设门方法进行三色或四色流式细胞术,可以很好地鉴别各系列,为白血病的诊断、治疗及预后判断提供了重要的实验室依据。

  2.4 HLA-B27的检测

  强直性脊柱炎(Ankylosing Spon-Dylitis,AS)是一种自身免疫性疾病,而HLA-B27(人类白细胞抗原B27)是具有高度遗传多态性的人类白细胞抗原B座位上的一个等位基因。1973年Brewerton等[8]报道HLA-B27与AS密切相关,Brown[9]报道AS患者HLA-B27阳性率高达94%,而正常人群中仅为9%。用FCM检测HLA-B27抗原,将单克隆抗体与外周血共孵育,裂解红细胞,洗涤固定后上机检测。文献报道,该法的假阴性和假阳性率小于5%,是一种适用于临床的、可信赖的检测方法[10]。由于此法无需分离细胞,比传统的微量细胞毒实验节约时间,应用特异性单抗检测抗原,可以排除交叉反应,提高检测的灵敏度和准确性。

  2.5 移植免疫

  目前移植免疫中FCM主要用于交叉配型(Flow Cytometry Cross-Matching,FCXM)和群体反应性抗体(Panel Reactive Antibody,PRA)检测。1983年Garovoy[11]首次提出了FCXM技术,经不断完善,已被广泛应用。研究表明,术前FCXM阳性的心脏移植患者,术后急性排斥反应发生率较对照组高,并且发生动脉粥样硬化的机率明显高于FCXM阴性患者[12];也有报道6例术后FCXM阳性的肝移植患者均在1个月以内发生了急性排斥反应,而FCXM阴性患者中仅17.4%的患者发生了急性排斥反应[13]。由此可见FCXM在器官移植中有着重要的应用价值。PRA检测的最新进展是免疫磁珠流式细胞仪分析方法(Flow Pratmbeads)。该方法是集智能化和自动化为一体的检测技术,灵敏度高,特异性高,传统的补体依赖性淋巴细胞毒试验(CDC)方法敏感性低、费时且人为误判多,移植后易发生超急性排斥反应,而ElISA方法很难指明PRA抗体的抗原特异性。Flow Pratm Beads不仅能检测出PRA含量,而且能指定PRA的种类(抗T细胞抗体,抗B细胞抗体、抗单核细胞抗体甚至抗血管内皮细胞抗体),可以检测多种类型抗体(IGG、IGM、IGA等),这给临床医生提供更具体更有价值的信息,以便更恰当地进行供者选择。

  3、新进展及应用前景

  流式细胞仪不断改进、测定方法迅速发展以及高质量试剂的研制,为提高FCM检测结果的准确性和分析能力提供了保障。长期以来FCM的应用一直陷于对细胞或颗粒的分析,随着胶乳颗粒在流式细胞分析中的应用,“液相芯片”技术的出现实现了流式细胞仪对可溶性物质的分析,实现了样本分析时的低样本量、多参数检测。另外,流式微球阵列(CBA)技术也属于液相芯片技术。这些技术将FCM的应用领域进一步扩展,发展了一种新的技术平台。可以预见,在未来免疫学基础研究和临床检测领域,流式细胞术的应用范围会进一步扩大,应用深度会进一步加强。虽然,这种方法还具有一些自身的缺点,如价格昂贵、对操作人员要求高等,但是这些缺点一定会随着科学技术的进步逐步被克服。


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