您的位置:首页>>公司动态>>行业资讯

流式细胞术急性分离小鼠小胶质细胞

发布时间:2022-05-13 10:37:46 阅读:1942次 来源:百度学术

  实验概要

  本文主要讲述了:从成年小鼠脑中分离单细胞,制成单细胞悬液,我们一个单细胞分离成单细胞悬液,除去髓鞘碎片,然后染色标记,以确定小胶质细胞的成分。细胞被固定,在多色流式细胞仪上读取。

  实验步骤

  1. 小鼠用pH值7.4,0.1M PBS彻底穿心灌注。

  2. 用剪刀去头。

  3. 剥开头骨的软组织。

  4. 除去下颌骨。

  5. 除去头骨延髓到上颌骨之间的组织。

  6. 手术剪刀,取出头骨顶部,顺时针方向切割,开始和结束于右后鼓膜钩。

  7. 舀出大脑,维持组织的完整性。

  8. 立即将脑组织置于预冷的流式细胞术缓冲液中(1%BSA 1mM的EDTA的 pH值7.4 0.1M PBS,50U/ml DNAseI)。如果计划标记神经元,应在缓冲液中添加l-谷氨酸以防止在制备过程中的神经细胞死亡。

  9. 用杜蒙5#镊子从大脑的外表面仔细剥离脑膜(硬脑膜、蛛网膜和软脑膜)。

  10. 使用手术刀作冠状切口分离大脑和小脑/脑干。

  11. 使用镊子分离小脑和脑干,小心剥离出第四脑室脑膜衬砌。

  12. 使用手术刀,纵向平分,小心剥离出大脑脉络丛及相关的脑膜组织。

  13. 进一步解剖到所需分析的脑区(如海马,大脑皮层等)。

  14. 将脑组织转移到15MLTenbroeck homogenizer中,其中含有10毫升冰冷的FACS缓冲液。

  15. 轻柔震荡3次破碎组织。

  16. 粗匀浆,经过70微米尼龙网状带有塑料柱塞的细胞过滤装置,每柱2次,产生单细胞悬液。

  17. 离心细胞,4ºC, 1200 转/10min,弃掉上清液,再加上细胞流式细胞仪的缓冲液。

  18. 用Miltenyi AutoMACS除去髓磷脂,根据指示髓鞘去除珠。

  19. 1× 流式细胞仪缓冲液洗细胞,4ºC,1100转/10min,弃掉上清液。细胞重置在100 UL预冷的,细胞流式细胞术的缓冲液中再转至细胞流式细胞仪管中。

  20. 把细胞标记上带有抗CD11b,CD45的细胞外的小胶质标记物、可修复的LIVE/DEAD染料或者任何其他所需标记(例如GFAP,NeuN,CD3e等),4度避光反应30min。

  21. 洗涤细胞2次,如步骤19所示。

  22. 在100-400uL含1%PFA PBS溶液(0.1M,PH=7.4)中重新悬浮细胞。4℃避光存储。

  23. 在流式细胞仪检测细胞。

  24. 首先用LIVE/DEAD设置gate,选择活细胞,然后依据脉冲宽度与面积比选择线性分布细胞,依据前向散射与侧散射比来消除碎屑。然后依据不同细胞类型的相应标记来获得等效和准确的细胞计数。

  小胶质细胞分离流程示意图,如图1

小胶质细胞分离流程示意图

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1143.html

注释:[本文仅供阅读]不代表企业及作者的立场,如侵权请联系删除,欢迎分享本文,转载请保留出处!

推荐服务

  • 分子实验

    分子实验平台为广大科研工作提供蛋白、RNA和DNA分子类分析及检测服务···

  • 细胞实验

    细胞实验平台为广大科研工作者提供原代细胞提取、鉴定和培养相关服务···

  • 病理实验

    动物实验平台为广大科研工作者提供动物寄养、疾病模型构建和体内验证···

  • 动物实验

    动物实验平台为广大科研工作者提供科研成果向产品转化的服务,转化方···

  • 精准医疗

    精准医疗平台为癌症患者提供肿瘤移植动物体内服务,模拟患者癌症发展···