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动物细胞基因组DNA提取步骤盘点

2022-09-07 10:42:40
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  实验原理

  本次DNA提取操作是以染色体的形式存在于细胞核内,制备DNA将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,同时保持DNA分子的完整。提取DNA的过程是指将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在下保持很高的活性。

  在提取DNA的反应体系中,SDS用于细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离,EDTA则抑制细胞中Dnase活性;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使起与DNA分子分离开来。

  实验材料

  (1)细胞裂解缓冲液:

  Tris (pH8.0) 100 mmol/L ;EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L; NaCL 20 mmol/L; SDS 10% ;胰RNA酶 20ug/ml。

  (2)蛋白酶K: 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中,用一次性过滤器过滤除菌,-20℃备用。

  (3)TE缓冲液(pH 8.0),高压灭菌后室温贮存。

  (4)酚:氯仿:异戊醇=25:24:1(体积比)。

  (5)NaAc 3 mol/L。

  (6)异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

  实验过程

  1、取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm3),尽量剪碎。放入匀浆器中,加入2ml细胞裂解缓冲液,然后充分研磨,至不见明显组织块,然后转入1.5ml 离心管中,以12000 rpm离心5min。

  2、弃掉上清,加入0.4ml细胞裂解缓冲液,迅速吹散沉淀。加入20ul蛋白酶K(0.2mg/ml),混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min,或转入37℃水浴12~24h,间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中。

  3、加入等体积酚:氯仿:异戊醇抽提一次,温柔混匀。4℃条件下,10000rpm,离心10min。

  4、轻轻吸取上层液面,注意不要吸到两层之间的白色沉淀。如上层液面中白色沉淀较多或浑浊可以再次加入等体积酚:氯仿:异戊醇抽提一次。

  5、向吸取的上清液中加入1/10体积的NaAc,轻柔混匀,然后加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇,轻柔混匀后,-20℃冰箱中沉淀过夜。

  6、12 000rpm 离心 20min,弃上清;加入-20℃预冷的75%乙醇,12000rpm 离心 15min 室握温干燥,加入适量无菌水溶解基因组DNA,存放于 4℃,如溶解不充分可轻摇溶解过夜。

  注意事项

  1、选取的组织须是新鲜材料,且处理时间不宜过长。

  2、操作过程尽可能在低温条件进行,避免基因组DNA降解或断裂。

  3、使用酚:氯仿:异戊醇,乙醇抽提或沉淀DNA时须轻柔操作,避免DNA降解或断裂。

  4、实验中会使用到有机试剂,须注意防护,并在通风条件下进行操作。

  常见问题及分析

图例

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