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EdU的检测原理是什么?EdU细胞增殖实验操作教程

发布时间:2022-09-07 10:33:23 阅读:12432次 来源:每日生物评论

  细胞增殖的能力是评价细胞、代谢、生理、病理状况、细胞活性、基因毒性等的重要指标之一。

  细胞增殖虽然与多种因素有关,比如细胞代谢活性、与细胞增殖相关的蛋白表达、ATP的浓度等等,但是检测细胞增殖现象的zui直接zui准确的方法就是用荧光探针直接检测遗传物质DNA的合成,这种方法是研究细胞增殖、信号通路、DNA修复及分化等等方向常用的方法。

图例

  目前,基于DNA的合成原理,人们最初开发了工具是BrdU染色法, 但是这种方法操作耗时长,往往需要过夜处理细胞,操作繁杂,比如需要DNA变性、抗原修复以及抗原抗体反应等操作,后来在BrdU的基础上,人们开发出了革命性的探针--EdU,这种方法不需要繁杂的操作,节约时间,且反应更灵敏和准确。并且与MTT/WST-1或者CCK-8这种依靠化学显色法只能得到一个折线图的方法相比,EdU 细胞增殖检测法可以得到高清细胞增殖现象数据图,可视化展示数据、更直观、更具视觉效果!

  EdU的检测原理是什么?

  EdU可以说是一款革命性的细胞增殖状态检测方法

  与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比, EdU只有BrdU抗体大小的1/500,在细胞内更容易扩散,不需要严格的样品变性(酸解、热解、酶解)处理,有效地避免了样品损伤,有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况,具有更高的灵敏度和更快的检测速度。

图例

  EdU细胞增殖检测法的操作教程

  一、首先用 EdU 来标记细胞

  注意:本实验样本是 Hela 细胞,如果使用其它类型的细胞,实验可能需要做调整。建议 EdU 起始浓度是 10 µM,或者根据细胞类型设置几个梯度预实验摸索zui佳EdU浓度,再进行正式实验。

  1.在六孔板里的盖玻片上培养细胞,使其生长至所需密度后处理细胞;

  2.用 10 mM EdU 溶液在无血清培养基中制备 2x EdU 工作溶液;

  3.预热 2x EdU 溶液,然后将 2x EdU 溶液添加到等体积含有实验细胞的培养基中,获得 1x EdU 溶液。例如,对于zui终浓度为 10 µM 的溶液,可用 20 µM EdU 的新鲜培养基替换一半含细胞的培养基

  注意:建议不要更换所有的培养基,因为这会影响细胞增殖速率;

  将处理好的细胞孵育12小时;

  孵育完成后立即进行步骤 B

  二、细胞固定和透化

  1.孵育后除去培养基,并向每个含有盖玻片的孔中加入2.5 mL含多聚甲醛的 PBS,室温下孵育15分钟;

  2.除去固定液,用2.5 mL PBS洗涤孔中的细胞5分钟,重复三遍;

  3.除去洗涤液,然后向前五个孔中加入2.5 mL通透液, 室温下孵育20分钟;

  4.除去通透缓冲液,用2.5 mL PBS洗涤每个孔中的细胞两次,除去洗涤液;

  5.立即进入步骤 C。

  三、 EdU 检测

  每孔使用 100 µL 反应混合物。反应混合物体积可根据实际情况进行调节,但必须按比例加入反应组分。

  1.制备 Click-iT 反应混合物。注意要按表中列出的顺序添加成分,否则反应将无法得到zui佳效果。配置好的 Click-iT 反应混合物必须在15分钟内使用。

  2.向每个玻片上加入 100 µl Click-iT 反应混合物,室温下避光孵育 30 分钟;

  3.除去反应混合物,用2.5 mL PBS洗涤每孔一次后,除去洗涤液;

  可选择步骤:进行核染色(DAPI 或 Hoechst 33342)或抗体标记

  提示:在孵育过程中一定要避光。如不需要其它染色,孵育后请直接进行成像和分析

  Abbkine EdU细胞增殖检测试剂盒发表的文献:

  1.Perilaldehyde activates AMP‐activated protein kinase to suppress the growth of gastric cancer via induction of autophagy

  作者:Y Zhang, S Liu, Q Feng 杂志名称:JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY IF:3.09

  2. In vitro mitochondrial-targeted antioxidant peptide induces apoptosis in cancer cells

  作者:W Zhan, X Liao, L Li 杂志名称:Onco Targets Therv IF:2.31

  文章来源:每日生物评论

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1563.html

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