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免疫组化操作步骤(附带操作需要注意的事项盘点 )

2022-09-05 10:43:20
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  免疫组化,是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及相对定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

图例

  一、洗载玻片

  二、二、用石蜡包埋组织

  三、将包埋好的组织切片,一般为5um,切片之后置于40 ℃温水中

  四、捞组织

  五、脱蜡,依次将载玻片放入xylene-xylene-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精每个试剂中放10min,若天气冷可适当延长时间

  六、抗原修复常用的修复方法从强到弱分为高压加热修复、微波修复和胰管修复三种。高压加热修复操作简单,效果优于其它修复方法。

  抗原修复的注意事项:

  (1)组织不能干。

  (2)选择抗原修复方法要因抗体而异。

  (3)该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。

  (4)抗原修复后至DAB显色的过程中,均需用PBS缓冲液

  七、血清封闭为了防止一抗与组织的非特异性结合,可用牛血清或山羊血清阻断这些位点。闭锁血清通常来自同一二抗动物,在室温下闭锁时间为10-30分钟。

  八、加一抗

  九、加二抗

  十、加SABC

  十一、加显色剂(显色剂的配置:在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀,然后加1滴显色剂B,摇匀,再加1滴显色剂C,摇匀) A:DAB B:H2O2 C:磷酸缓冲液

  十二、复染

  将显色后的片子用清水冲洗一段时间后,浸泡于hematoxylin中染色,一般动物组织为半分钟,植物组织3-5min。

  十三、脱水

  十四、封片

图例

  操作需要注意的事项:

  1. hematoxylin复染时间需要摸索,尤其阳性染色也在细胞核上。

  2. DAB 显色时间需要达到最优化,镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。

  3. 抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育最好在 4 度过夜。

  4. 切片脱蜡和水化要充分;加反应液时要覆盖组织充分;每次加液前甩干洗涤液,但

  又防止干片;用组化笔画圈时尽量画大一点,否则墨水排斥液体,引起片周边干片。

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