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小鼠胚胎干细胞的分离与培养有效的方法

2022-07-24 10:34:39
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  小鼠胚胎干细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化的条件,来保持其高度未分化潜能。使用胚胎成纤维细胞作为饲养层培养ES细胞。培养的ES细胞呈集落状生长,细胞排列紧密,呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ES细胞最普遍使用而且有效的方法。

  【材料】

  1.组织来源孕鼠(12.5~15.5日龄),饲养层细胞STO细胞(SLN或STO/N/L细胞株)。

  2.培养用试剂

  (1)Hanks液。

  (2)冲胚液:DMEM培养液,含10%牛血清(Calf serum, CS)和25 mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid, HEPES) (pH 7.4)。

  (3)消化液:0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合消化液,用无钙镁PBS配制,pH 7.4。

  3.培养基配方和制备

  (1) ES培养液:DMEM培养液(高糖),含有15% CS,4.5g/L葡萄糖、2mmol/L谷氨酰胺、0.lmmol/L β-琉基乙醇,1 mmol/L丙酮酸钠、0.1mmol/L非必需氨基酸、10001U/mL LIF(用STO饲养层时不用LIF)。

  (2)小鼠胚胎成纤维细胞培养液:低糖DMEM含有10%小牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。

  4.实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、200目尼龙网、50m1和15 ml离心管、手术刀片。

  【方法】

  1.取材取受孕3.5天的小鼠脱颈断髓处死,剪开腹腔取出子宫角,冲胚液冲洗子宫角,收集胚胎。将小鼠囊胚随机放人铺有饲养层细胞STO的4孔培养板上,每孔1枚,每孔加ES培养液,置37℃,5% C02饱和湿度的培养箱中培养。培养4~5天后,无菌玻璃针拨动形似鸟巢状的小鼠细胞团衍生物,使其与滋养层细胞分离。

  2.消化D-Hanks液洗细胞团2次,用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化细胞团5分钟,直至细胞团松散,离散成小细胞团块,脱离培养皿的底部。加ES培养液终止反应。

  3.分离细胞将细胞悬液移人离心管中,1000r/min离心5分钟,弃上清液。

  4.接种与培养细胞计数,将细胞以3x106个/ml密度接种至预先铺有饲养层细胞的培养板上,4孔培养板上,置37℃,5% C02饱和湿度的孵箱中培养。如此每隔2~3天重新传代1次。凡不具分化表型的小鼠ICM集落再继续传代培养。

  【结果】

  以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,培养24~48小时后,胚胎从透明带中孵化出来,随着饲养层的移动而黏附到培养皿上。此时可清楚地辨别出内细胞团。分离隆起生长的胚胎内细胞团并继续培养,48小时后ICM迅速生长。培养4~5天后,ICM长成一簇簇的细胞团且未有分化现象,形似鸟巢状的小鼠细胞团衍生物,ES细胞集落的特征呈鸟巢状(图6-1)。


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