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蛋白质转印原理,大分子量蛋白转印的5个技巧

发布时间:2022-06-29 10:32:22 阅读:13072次 来源:昆明纳瑞

  做western blot印迹膜时,较大的蛋白质众所周知是难以处理的。 特别是,您可能很难实现良好的转印效率。 在某些方面,蛋白质难以朝着你想要的方向前进。

图例

  我们将给5点建议,帮助胶上大分子量蛋白的转印。

  01

  牺牲胶的韧性来提高效率

  低浓度的丙烯酰胺凝胶可能难以操作。一旦手指触摸它就会撕裂?但是,与高浓度的凝胶相比,大蛋白将更有效地从较低浓度的凝胶中移出(分辨率更好)。因此,提高你的灵活性和耐心,尝试6-7.5%的凝胶。或者可以尝试使用梯度凝胶,可以同时分辨小分子量和大分子量蛋白质。

  02

  去除去垢剂

  较大的蛋白质可能在凝胶中沉淀,抑制转印。在SDS-PAGE期间添加的SDS通常会解决这个问题,但较大的蛋白质可能需要更多的SDS。您可以在转印缓冲液中添加最多0.1%的SDS以阻止沉淀的产生。因为SDS抑制蛋白质与膜的结合,因此请尝试从低浓度的SDS开始(例如0.0375%),然后逐步提高。

  如果确实在转印缓冲液中添加了SDS,则需要重新优化其他转印条件,如转印时间和电流,以防止蛋白透过膜。

  03

  降低甲醇浓度

  甲醇与SDS具有相反的作用。虽然甲醇增加蛋白与膜的结合,但它从蛋白质中剥离SDS。因此,降低转印缓冲液中的甲醇浓度也有助于防止蛋白沉淀。您可以将浓度降低到10%或更低。如果您使用的是PVDF膜,则可以完全省去甲醇。在使用之前,不要忘记用甲醇将膜激活!

  甲醇也会导致凝胶收缩,所以如果减少甲醇,你的凝胶会膨胀得更多。这也有助于转移大分子量蛋白。但您可能需要使用比正常情况稍大的滤纸和膜。

  04

  慢速转印大分子量蛋白

  大分子量蛋白想要获得良好的转移效率可能需要更多时间。快速移动那些大分子可能很困难。尝试以较低的电压过夜转印。只是不要忘记保持转印要在低温环境!

  05

  使用湿转

  虽然半干转印可能更适合设置并且需要较少的缓冲液,但它确实有其缺点。半干转印通常比湿转移效率低,并且不能增加转印时间以适应更大的蛋白。转移大蛋白时最好坚持使用湿转。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1316.html

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