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行为神经科学入门:标准化实验和使用病毒载体

发布时间:2022-06-08 10:24:50 阅读:11262次 来源:本站

  行为神经科学的目的是定义与特定行为相关的大脑区域。这是一个非常古老的科学分支,可以追溯到几百年前,与心理学和哲学(身心问题)有着历史联系。由于遗传操作工具的可用性,小鼠已成为许多行为研究的首选模型,尽管也使用其他生物体,如大鼠或斑马鱼。随着病毒载体的发展,行为神经科学家现在可以精确控制某些基因的表达地点和时间,以研究它们在特定行为中的作用。这篇博文将介绍行为神经科学,并解决所有行为研究中使用的实验设计注意事项。

  行为测试的一般注意事项

  作为实验室行为测试的一般考虑因素,需要高水平的实验控制,因为看似微小的外部因素会对结果产生相当显着的影响,并导致测试组的可变性。例如,如果实验者从家里的笼子里捡起一只老鼠并将其放入实验装置中,老鼠就会受到压力。在接下来的测试中,它可能会移动得更快,并且会扭曲测量运动的结果。可能需要给小鼠一些时间来适应测试设备。试验动物的一般压力水平也可以通过实验者在实验前几天每天处理几分钟来降低。然而,处理可能会对某些测试产生负面影响,因此并不总是推荐使用。

  应避免强光或噪音等环境影响,因为这也会增加压力水平并影响行为。需要考虑的一个事实:啮齿动物可以听到人类听觉范围之外的超声波频率(例如,> 20 kHz,由荧光灯泡产生)。

  实验装置应在动物之间彻底清洁,因为前一只动物留下的嗅觉刺激(例如:尿液)可能会分散注意力。如果不清洗,在实验系列结束时测试的动物的行为将与开始时测试的动物非常不同(分心)。

图例

  使用病毒载体在行为神经科学中进行基因操作

  行为测试通常与基因操作一起进行,以便将行为与特定基因或大脑区域联系起来。在进行基因操作时,需要做出两个主要决定: 1. 哪种修饰?2. 应该使用哪种病毒载体?

  修改基因表达

  一般而言,人们可能希望在特定大脑区域实现神经元的抑制或激活。一种选择是过度表达直接改变神经元功能的基因,例如受体亚基或神经营养因子。另一种选择使用光遗传学来控制神经元活动,通常是通过光激活离子通道。同样,化学遗传学工具是设计的化学激活通道。两者都被引入神经元中,根据通道蛋白的选择,它们可以在光(或药物)应用时触发神经元兴奋或抑制。

  基因操作还可以降低某些基因的表达水平。一种流行的方法是在转基因 flox 动物上使用Cre 重组酶,以时间和局部定义的方式在 DNA 水平上引入修饰。这使科学家能够根据特定大脑区域的基因表达得出结论,避免其他区域的这种修改产生的副作用。另一种策略是用RNAi敲低一个基因。在这里,针对该基因的短序列被克隆到病毒 shRNA 表达载体中,载体颗粒被递送到感兴趣的大脑区域。

  AAV 还是慢病毒?

  AAV 和慢病毒载体都用于脑内注射。AAV 颗粒更小,如果需要更广泛的扩散,可能更可取。另一方面,慢病毒载体是较大基因的优良包装载体——它们最多可容纳 8 kb,而 AAV 只能携带约 4.5 kb。

  不同的 AAV 血清型对特定的细胞类型有偏好。例如,AAV1 和 AAV9 血清型具有很强的神经元趋向性,AAV5 既针对神经元又针对星形胶质细胞,AAV4 主要针对星形胶质细胞。在大多数情况下,慢病毒载体是假型的,VSV-G 通常介导广泛的细胞趋向性,并且在立体定向注射后具有高百分比的神经元靶向。在我们之前的博客文章中 找到有关选择AAV或慢病毒载体的更多详细信息。

  病毒载体注射

  病毒载体允许对基因表达操作进行严格的空间和时间控制。使用立体定向框架将它们注射到被怀疑涉及某种类型行为的特定大脑区域(参见 Stoica 等人,2013 年的评论)。载体传递也可以通过注入脑室液(ICV,脑室内)来实现,以尽量减少组织损伤;然而,使用这种方法,载体向感兴趣区域的传播可能非常有限,特别是在成年动物中,并且不针对特定区域。立体定向注射的其他一些技术考虑因素是:

  载体滴度:传染性病毒颗粒的浓度必须足够高以最大化可能的结果。通常,AAV 必须至少在 10 12 -10 13 vg/ml(每毫升载体基因组)左右,而慢病毒载体必须在 10 8 IU/ml(每毫升感染单位)左右,以最大限度地发挥可能的效果。

  注射参数:注射针应尽可能细,以尽量减少对脑组织的损伤。注射速度必须很慢,以使病毒颗粒从注射部位扩散开,并且还要尽量减少由于添加液体的压力增加而对组织造成的损害。体积应该是最小的以最小化进入组织的压力,但必须足够大以靶向更大的区域,通常为几百 nl。或者,对于较大的大脑区域,可以考虑重复交错注射。

  时机:病毒载体转基因的高表达水平通常发生在注射后两周。因此,在行为测试前两周左右适当安排注射时间至关重要。注射和测试之间的时间窗口将根据它是过表达基因、通过 RNAi 下调还是使用 CRISPR 进行基因编辑/删除而有所不同。在某些情况下,几周后可以观察到表达效率的下降,这也可能取决于转基因或启动子的选择。

  您可以使用病毒载体研究的行为

  通过调节神经元基因的表达和活动,您可以使用病毒载体来研究各种行为——从基本类型(如运动和运动协调)到更复杂的情况(如学习和记忆)或情绪状态(如焦虑或抑郁)。在即将发布的博客文章中,我们将详细讨论其中一些行为研究,并分享科学家如何使用 Addgene 的质粒库和病毒服务进行行为研究。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1237.html

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