全球许多研究人员提出的备受追捧的问题之一是——“异源细胞库中单个细胞的基因表达谱是什么？” 虽然大规模细胞术是当前单细胞分析的“热门”方法，但良好的旧流式细胞术可以帮助我们对单细胞进行快速分析。

　　鉴于蛋白质是所有细胞功能的协调者，同时检测与表面、细胞质和核区室相关的蛋白质为测试我们的许多假设提供了一种强有力的方法。流式细胞术可用于以 >10,000 个细胞/秒的速度检测每个细胞多达 18 种蛋白质。如果您想在实验中使用流式细胞术技术并询问“如何”，请继续阅读。

　　包括流式细胞术在内的基于抗体的检测技术基于“知己知彼”的方法。换句话说，我们需要既能识别我们感兴趣的蛋白质，又能与荧光染料结合来确定蛋白质表达的抗体。如果商业上可用的抗体已经以各种荧光团偶联形式存在，则这项任务相对容易。

　　由外而内的免疫染色方法

　　检测细胞表面的蛋白质是免疫染色的第一步。请记住在冰上进行整个表面染色程序，以减缓细胞膜和细胞质之间的抗原循环。此外，您必须在存在 Fc 阻断剂的情况下进行该程序，以减少细胞的非特异性染色。

　　下一步是窥视细胞内部，以识别质膜内叶、细胞质和细胞核上的蛋白质。这包括首先使用交联剂固定细胞以将抗原-抗体复合物固定在表面和细胞结构上。随后是透化（即在细胞膜上打孔）以允许抗体进入细胞内以结合和检测蛋白质。始终先固定细胞，然后再透化细胞 - 否则透化细胞的内容物可能会泄漏并导致您感兴趣的蛋白质丢失。

　　最常用的固定剂是 4% 多聚甲醛、95% 乙醇、100% 甲醇和 100% 丙酮。可以优化固定剂处理的浓度、温度和持续时间以获得所需的结果。然而，使用固定剂的较长孵育时间有时会导致表位被掩盖或破坏。一些固定剂，如甲醇和丙酮，可以固定和渗透细胞（节省时间！）。

　　当需要额外的透化步骤时，通常使用NP-40 、Triton-X 和皂苷等去污剂。它们通过在质膜和核膜上制造足够大的孔来提供抗体。与固定剂的情况一样，透化处理的浓度和持续时间确实会影响染色模式。

　　简单的出路

　　与往常一样，许多市售试剂盒可用于细胞固定和透化。试剂盒的选择取决于细胞内目标蛋白质的位置和试剂盒试剂的组成。例如：BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization 试剂盒通常可用于细胞内细胞因子染色。Cytofix 缓冲液含有甲醛作为固定剂，Perm/Wash 缓冲液含有温和的去污剂皂甙。重要的是要记住，所有细胞内染色步骤（例如，抗 IFNα 抗体）必须在 Perm/Wash 缓冲液存在下进行，以保持细胞处于透化状态。

　　如果您想对细胞核内的转录因子和信号分子进行染色，比如 Foxp3 或 Bcl6，那么像 ebioscience Foxp3/转录因子缓冲液套装这样的试剂盒效果很好。这些转录因子染色试剂盒通常含有甲醛作为固定剂，并结合使用更强的去污剂（如 Triton-X 或甲醇）以实现通过核膜的可及性。

　　提示与技巧

　　如果您使用 FACS 管进行染色，则所需的缓冲液量很大。一种简单的选择是使用 96 孔 u 或 v 底板进行染色。

　　固定后，细胞结构交联，因此蛋白质的循环不再令人担忧。因此，可以在室温下进行额外的透化和染色步骤。

　　甲醛是一种致癌物质，因此在处理这些缓冲液时应采取最大的安全预防措施。

　　固定和透化后，细胞变得更小和半透明。因此，如果您看不到您的细胞团块，请确保您没有丢失您的细胞！

　　由于细胞大小的变化，在流式细胞仪上分析细胞内染色细胞时需要更高的电压设置。如果您在流式细胞仪上找不到您的细胞，只需稍微提高电压即可。如果您不确定电压设置，请寻求核心设施经理的帮助。

　　市售的可固定活力染料可用于消除死细胞污染引起的背景噪音。

　　固定后，细胞可以在黑暗中在 4ºC 的 FACS 缓冲液中重悬过夜，然后可以在透化和染色后在流式细胞仪上进行分析。然而，有些抗体可能会表现出降低的染色强度。

　　尽管建议在固定前进行表面染色，但某些抗原（如 CD4）可以在固定/透化后与核抗原（如 Foxp3）同时染色。但此快捷方式仅适用于某些抗体克隆，因此请确保进行试运行。

　　如果您的细胞中含有 GFP 等报告蛋白，则在使用含有甲醇的缓冲液后，荧光可能会完全消失或减弱。一种解决方案是使用含有甲醛的替代缓冲液。对我有用的一个技巧是首先使用 BD cytofix/cytoperm，然后使用 ebioscience foxp3 染色试剂盒处理细胞，以同时检测荧光蛋白和 Foxp3 等核抗原。

　　总之，涉及细胞固定/透化的免疫染色需要大量优化/反复试验。请放心，一旦您掌握了满足您个人需求的技术，就不会回头。它打开了通往细胞生物学神奇王国的大门！