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通过流式细胞术进行细胞周期分析:在生命周期中畅通无阻

发布时间:2022-06-08 10:37:08 阅读:13182次 来源:百度学术

  在过去的几十年中,哺乳动物细胞周期已得到充分证明。虽然细胞在循环中移动时有很多检查点,但我们可以根据细胞核中的 DNA 含量非常简单地将细胞周期分为三个阶段。

  当细胞处于静止状态或不分裂时,它们具有正常的 DNA 补体(即,在正常人类细胞中,这相当于 46 条染色体)。当细胞开始增殖时,它们进入细胞周期的 S(合成)期并开始复制 DNA。它们继续制造新的 DNA,直到它们的 DNA 含量加倍,此时它们进入有丝分裂并产生两个可以退出细胞周期或继续进行另一轮细胞分裂的子细胞。真的很简单!

  正在死亡的DNA?不,它只是一个漂亮的颜色!

  我们可以使用细胞周期分析来评估细胞处于哪个阶段,方法是用显色或荧光染料染色 DNA。流式细胞术是一种完美的荧光定量技术,我们可以利用一系列荧光染料与 DNA 结合的事实来做到这一点。事实上,DNA 分析是 1960 年代流式细胞术的首批应用之一,流式细胞术的 DNA 分析现在用于研究应用和临床。

  在设计实验时需要考虑哪些事项?

  了解您的细胞仪!

  尽管许多现代细胞仪具有多个激光激发源,但您需要确保它具有适合您要使用的染料的一个。它还必须具有正确的光学检测滤光片。这导致您需要了解要使用的染料的激发和发射特性。

  那么,我使用哪种染料?

  除了荧光之外,染料还必须以化学计量方式结合。即,与细胞中的 DNA 量成比例。快速搜索会发现其中的许多染料,但它们都有不同的光谱特性。

  许多人被几乎所有流式细胞仪中都存在的蓝色 (488nm) 激光所激发。这些染料包括碘化丙啶、7-氨基放线菌素-D 和SYTOX® Green。

  有些被其他常见的激光线激发,例如红色(640nm)激光;例如TO-PRO-3 碘化物和DRAQ5™。

  一些,如赫斯特染料需要紫外激光激发,这是不太常见的。

  因此,了解您的细胞仪中有哪些激光器将使您能够选择使用哪种染料。

  如何让染料进入细胞?

  对于大多数DNA 结合染料,细胞需要固定或透化才能使染料进入细胞,因此它们实际上是死的。使用的固定剂包括乙醇、甲醇和甲醛;细胞透化剂包括Triton-X100、NP-40 和皂苷。每个都有其优点和缺点。一般来说,使用透化方法可以看到更清洁的轮廓,但这些方法不允许长期储存样品。固定剂确实允许储存,选择的固定剂通常是 70% 乙醇。

  我需要让我的细胞保持活力

  好吧,现在您的选择更加有限。只有少数染料无需任何固定或透化步骤即可进入活细胞;即来自 ThermoFisher Scientific的Hoechst 33342、DRAQ5™ 和DyeCycle 染料。但是,需要注意:您使用的每个细胞系统都需要优化染料浓度和孵育时间,并确保评估细胞毒性和细胞功能!但是,这些染料和预防措施可以让您在分选实验中保持细胞存活。

  还有什么我需要知道的吗?

  运行 DNA 分析实验与进行多重免疫表型实验时,细胞仪的设置略有不同。通过 DNA 分析,我们处于高分辨率数据分析的领域:处于静止状态的细胞和处于有丝分裂状态的细胞之间只有双倍的荧光,因此我们使用线性放大来查看和显示我们的细胞仪上的荧光。

  我们要确保我们测量的是单个细胞,而不是两个粘在一起或通过激光束非常靠近的细胞;因此,去除细胞双峰很重要。这可以通过分析细胞穿过激光束时产生的荧光脉冲来实现。与单个细胞相比,细胞双峰通过光束需要更长的时间,并且脉冲更宽。

  使用低压差运行样品,以使样品芯尽可能小,从而将变化保持在最低限度。这将导致具有低 CV(变异系数)的 DNA 直方图,并将允许更好地区分细胞周期阶段。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1239.html

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