在现实生活中，细胞被指示为了有机体的更大利益而自杀。程序性细胞死亡（细胞凋亡）在多细胞生物的发育过程中很重要。你会欣赏的一个很好的例子是蝌蚪变成青蛙时尾巴的消失。相反，细胞凋亡的缺乏导致不受控制的细胞生长和各种恶性肿瘤。因此，科学家们一直在寻找研究细胞死亡的新方法。流式细胞术是一项了不起的发明，它可以让您检查每个细胞的表面蛋白表达和内部蛋白分泌。流式细胞术彻底改变了免疫学领域，并继续推进细胞生物学研究。目前，科学家们已经开发出几种不同的标准方法来使用流式细胞术研究细胞死亡。1今天，我想介绍一种相对简单可靠的方法，通过检测细胞表面的磷脂部分来研究细胞死亡。

　　膜联蛋白 V 染色如何在细胞凋亡检测中发挥作用？

　　Annexin V 是一种以钙依赖性方式与磷脂酰丝氨酸 (PS) 结合的蛋白质。由于 PS 仅在细胞经历细胞死亡时存在于细胞表面，因此它是研究细胞凋亡的有用试剂。通过加入碘化丙啶 (PI) 或 7-AAD 等细胞渗透性染料，通过流式细胞术进行的膜联蛋白 V 染色是观察细胞死亡不同阶段的快速且可重复的方法（见图 1）。通过对细胞群进行适当的门控，图 1 显示了使用 Annexin V 和 7-AAD 进行凋亡的细胞的典型染色模式，第 1 象限 (Q1) 显示了 Annexin V 和 7-AAD 阴性群，它们是健康细胞。Q2 显示了 Annexin V 阳性和 7-AAD 阴性群体，它们是正在发生凋亡的细胞。最后，Q3 代表 Annexin V 和 7-AAD 阳性群体，

　　膜联蛋白 V 染色程序

　　以下是膜联蛋白 V 染色的典型程序

　　注意：所有洗涤和孵育均应在 1x 结合缓冲液中进行。2

　　在 PBS 中收获和洗涤细胞

　　在含有钙的 1x Annexin V 结合缓冲液中悬浮细胞

　　添加正确浓度的荧光染料偶联的 Annexin V 2

　　在室温下孵育 15 分钟

　　用结合缓冲液洗涤两次

　　添加 PI 或 7-ADD 并孵育 5 分钟

　　将样品悬浮在 Annexin V 结合缓冲液中并尽快分析

　　使用 Annexin V 染色研究细胞死亡的一些要点

　　1. 绑定是可逆的，需要特定的缓冲液

　　由于其结合需要钙，因此该测定需要使用 Annexin V 结合缓冲液，通常在您购买试剂盒时提供。请注意，结合是可逆的，应尽快运行样品以避免背景水平的增加。

　　2. 为 Annexin V 选择合适的荧光染料。

　　当运行多种颜色时，这通常是当今任何分析的情况，混合和匹配您的荧光染料以避免光谱重叠和补偿问题

　　3. 需要细胞渗透染料（PI 或 7-AAD）且无法固定

　　膜联蛋白 V 测定法需要加入 DNA 结合染料（即 PI/7-AAD）来判断细胞是否处于早期（膜联蛋白 V 阳性，7AAD 阴性）阶段并正在经历细胞凋亡。PI/7AAD 的问题是它们必须保留在缓冲区中进行分析。因此，细胞固定不是一种选择。再加上 Annexin V 的可逆结合特性，该检测需要仔细规划，并且比其他允许固定以保持细胞状态的检测更具时间敏感性。

　　有许多方法可以检测细胞凋亡。例如，您可以执行蛋白质印迹分析来检测促凋亡半胱天冬酶的激活。此外，您还可以进行“隧道”分析来查看双链 DNA 片段化，这是晚期细胞凋亡的指标。然而，Annexin V 染色是迄今为止最直接的并且需要更少的时间。首先，膜联蛋白 V 染色着眼于细胞表面的细胞凋亡早期和 PS 的简单染色。与“隧道测定”相比，它需要更少的孵育时间，后者需要掺入酶来标记双链 DNA 的断裂末端。因此，下次如果您正在考虑研究程序性细胞死亡，请尝试膜联蛋白 V 染色方案！