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Tet-on/off 系统—实现基因的诱导表达

发布时间:2022-06-16 10:27:16 阅读:15832次 来源:维真生物

  1992年Goseen等人成功的利用原核基因调控元件构建了四环素(tetracycline,Tet)真核细胞基因调控表达系统。目前,此系统已被广泛应用于基因功能和基因治疗领域的研究。

  1.四环素调控表达系统的基本原理

  Tet调控表达系统通过诱导药物(如四环素和强力霉素等)改变调控蛋白的构象,从而达到调控目标蛋白表达的目的。

  Tet调控基因表达系统是以大肠杆菌Tn10转座子上Tet抗性操纵子为基础而建立的。Tet阻遏蛋白(Tet repressor protein, TetR)与Tet操纵子(Tet operator, TetO)能够特异性结合。当无诱导药物存在时,TetR会与TetO结合,从而阻断下游耐药基因的表达;当有诱导药物存在时,TetR的构象会发生改变,并从TetO上脱离下来,使下游耐药基因得以表达,细菌从而获得耐药性。

图1. 四环素抗性菌中Tet与TetR/TetO系统作用原理

图1. 四环素抗性菌中Tet与TetR/TetO系统作用原理

  2. Tet-on调控系统

  利用TetR和TetO特异性结合的特点,多种类型的Tet调控系统逐渐发展起来。其中, 应用较广泛的为Tet-on激活型系统。

  Tet-on系统由调节表达载体和反应表达载体组成。调节表达载体包含一个人巨细胞病毒早期启动子(PhCMV)和反义Tet转录活化因子(reverse tetracycline transcriptional activator,rtTA)。其中rtTA由反义TetR(reverse TetR, rTetR)和单纯疱疹病毒(HSV)VP16 蛋白C端的一段转录激活区域融合而成。反应表达载体由Tet应答元件(Tet-responsive element, TRE) 、CMV启动子(minimal CMV promoter, PminCMV)及目的基因组成。其中TRE是7个重复的TetO序列。

  01 Tet-on原理:

  rtTA是由tTA突变4个氨基酸形成,它的表型与tTA相反。生理条件下,rtTA与TRE不结合,由于PminCMV缺少增强子,因此目的基因不表达;给于DOX后,DOX与rtTA的结合体与TRE结合,从而启动基因表达。

图2. Tet-On原理示意图

图2. Tet-On原理示意图

  02 Tet-off原理:

  Tet转录活化因子(tetracycline transcriptional activator, tTA)是由TetR的1-207个氨基酸和单纯疱疹病毒VP16激活结构域的C端127个氨基酸组成。VP16的增加使得TetR由转录抑制因子变为转录激活因子。生理条件下,tTA主动与TRE结合,启动基因表达;若给于DOX后,DOX与tTA的结合体与TRE解离,从而抑制基因表达。

图3. Tet-Off原理示意图

图3. Tet-Off原理示意图

  3. Tet-on调控系统的优势

  高效率:无诱导时目的基因表达水平低,最高诱导倍数可达10000倍;原核来源的TetR和TetO特异性结合,哺乳动物内无类似靶序列。

  精准调控:药物剂量及用药时间可控。

  安全:Tet及其衍生物应用多年,安全可靠;低剂量即可获得良好的效果。

  可逆性:去除诱导剂后可使系统关闭;可反复加入诱导,多次启动诱导。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1271.html

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