小麦总RNA的提取实验步骤

　　1. 所有容器高温灭菌两次，DEPC高温灭菌，所有的试剂用DEPC配制，高温灭菌。

　　2. 在一灭菌2mL管中加入：5mol/L异硫氰酸胍0.7mL、苯酚0.4mL、NaAc(pH4.0) 0.1mL。

　　3. 称取0.2g小麦黄化苗的叶片，迅速在液氮中研磨成粉末，转入已准备好的离心管中，剧烈震荡。

　　4. 混匀，冰浴30min。

　　5. 4℃，12000rpm，10min。

　　6. 上清至另一离心管中加0.4mL氯仿，剧烈震荡。冰浴放置5min。

　　7. 4℃，12000rpm，10min。

　　8. 弃有机相(下层) 加入0.4mL氯仿和0.4mL酚，室温放置5min。

　　9. 4℃，12000rpm，10min，弃有机相，加入等体积异丙醇。-20℃放置1h。

　　10. 4℃，12000rpm，10min，沉淀用70%乙醇洗两次。

　　11. 室温稍干燥。

　　12. 沉淀加20μLDEPC水溶解(-20℃保存)

　　13. RNA电泳：1％琼脂糖胶20mL，8μL样品，1μL样品缓冲液，1μLSYBR，100V恒压电泳，测OD260和OD260／OD280。

　　小麦总RNA的提取注意事项

　　1. 步骤1目的是去除RNA酶(外源)的影响。高温灭菌两次可以破坏RNA酶的复性过程，虽然RNA酶极易复性，但两次连续的高温会打乱它的复性历程，从而使RNA酶失活。 DEPC是RNA酶的非竞争性抑制剂。DEPC可以与RNA酶的活性中心的组氨酸咪脞环上的N结合，从而使RNA酶失活。因为DEPC能与RNA的N结合，从而修饰RNA，所以必须将DEPCzui终除去。在高温灭菌时，DEPC因高温分解而挥发。UV也能修饰RNA，实验时应避免。DEPC灭菌后称为DEPC水，它是不含DEPC的。实验过程中要勤换手套，必要时要在超净工作台中进行。

　　2. 必须提前准备好变性剂。异硫氰酸胍可以变性RNA酶，也可以破细胞。本试验不可以用酶法破细胞。因为蛋白酶K的适合的条件也可以使RNA酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA在有机相(酚相)中，而在碱性条件下，DNA和RNA都在水相中，无法分离。苯酚用于抽提DNA和蛋白质。

　　3. 低温防止内源性RNA酶降解RNA。剧烈震荡是使所有的细胞散开，浸在变性剂中。低温的细胞在相对高温的液体中是会形成一团，这样就会使内部的RNA没有水解RNA的机会。小麦的黄化苗因为没有光合作用，所以含糖少，易于抽提。

　　4. 步骤6目的是去除脂类。

　　5. 步骤8目的是去除脂类和蛋白质。

　　6. 步骤9目的是去除糖，脱水，因为体系高盐(2mol/L NaAc)，所以可以使RNA沉淀。

　　7. 步骤10注意因为提出的量很少，可能不可见，所以离心要有方向标记。

　　8. RNA是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因为有太多的糖的残余。

　　9. DEPC水中应不含RNA酶。