冰冻组织切片制作实验试剂

　　液氮，干冰，1％明胶，4％多聚甲醛，PBS，含1％NP-40的PBS，3％BSA／PBS稀释抗体，辣根过氧化物酶标记的二抗，DAB／金属盐试剂，3％过氧化氢，0.3％(W／V)氯化镍贮存液，Harris苏木精，乙醇

　　冰冻组织切片制作实验设备

　　载玻片，Whatman 1＃滤纸，低倍光学显微镜

　　冰冻组织切片制作实验材料

　　未受损伤的组织

　　冰冻组织切片制作实验步骤

　　1. 将未受损伤的组织切剖成小样本，约lcmXIcmX0.4cm。

　　2. 将标本放在卡片的一端。标记该卡片，将带有标本的一端浸入液氮中。60s后，取出标本并放在干冰上。修剪卡片，使其大小刚好比组织块稍大些，转入预冷的(-70℃)带有标记的小瓶中。

　　3. 切片前，用1％明胶包被洁净的载玻片。加热至50℃使明胶溶于水中，冷却，加入0.02％叠氮钠。将玻片浸入明胶溶液中30s，取出，自然干燥。

　　4. 按照仪器使用说明书，用低温恒温器制备冷冻切片。通常切片厚度在5-10gm之间。用包被过的载玻片收集切片。

　　5. 让切片自然干燥。浸入新鲜配制的4％多聚甲醛中2min。

　　6. 用PBS洗数次，放入含1％NP-40的PBS中5rain。用PBS洗数次。

　　7. 将带有组织切片的载玻片放在湿盒中。加合适稀释度的一抗，用含蛋白质的溶液如3％BSA／PBS稀释抗体。

　　单克隆抗体选用杂交瘤细胞培养上清(特异性抗体浓度为20-50gg／m1)。小鼠腹水、纯化的单克隆抗体和多克隆抗体，以及粗制的多克隆抗血清应该测试其稀释度，以使特异性抗体的浓度在0.1～10ug／m1之间。如果特异性抗体的浓度是未知的，则制备并测试初始制品的不同稀释度(1：10，1：100，1：1000和1：10 000)。

　　8. 将玻片置湿盒中于室温下孵育至少60min。对于某些反应来说，孵育时间可延长至24h，以增加其敏感性。

　　9. 用PBS洗3次，每次5min以上。

　　10. 加辣根过氧化物酶标记的二抗(特异性针对一抗)。这些试剂可以购自不同的经销商。如果二抗的确切用量是未知的，测试1：50—1：1000稀释的二抗。用含蛋白质的PBS稀释，如3％BSA／PBS。

　　11. 将样本置湿盒中，于室温下孵育30min。

　　12. 用PBS洗3次，每次5min以上。

　　13. 配制DAB／金属盐试剂。将6mg DAB溶于9ml 0.05mol／L Tris缓冲液(pH7.6)中。加lm[0.3％(W／V)氯化镍贮存液(可用相同浓度的氯化钴代替)。加0.1ml 3％过氧化氢。如果出现沉淀，用Whatman 1＃滤纸(或相似品)过滤。

　　14. 将上述溶液加到标本中。在低倍光学显微镜下观察。当形成足够的棕／黑色沉淀时，用水冲洗以终止反应。通常这一反应过程约需1-20min。

　　15. 加数滴Harris苏木精。孵育约5min。时间长短取决于染色的强度。

　　16. 用水轻柔冲洗。

　　17. 通过各级乙醇使标本依次脱水。在75％乙醇中孵育两次，每次3min，95％乙醇中2次，每次3min，100％乙醇中2次，每次3min。自然干燥。

　　18. 加一小滴DPX至标本上。小心在其上面放一盖玻片(1＃) 避免产生气泡。用纸巾去除多余的液体。DPX很快可以凝固，样品便可观察并照相。