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荧光减一对照

2022-05-20 10:34:43
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  荧光分子被光的光子激发。这将分子提升到更高的能量状态,并且为了释放该能量,该分子可以发射能量低于激发光子的光光子。当我们谈论这个发射的光子时,我们通常会考虑发射最大值。但是,如果查看诸如 FITC 之类的分子的发射光谱,很明显可以发射一系列可能的光子,从 Em max一直到超过 600 nm。这条曲线实际上是一条概率曲线,曲线越高,发射该波长的光子的可能性就越大。

图 1:荧光素的发射光谱。突出显示了两个过滤器。

  图 1:荧光素的发射光谱。突出显示了两个过滤器。

  通过覆盖我们的流式细胞仪具有的不同过滤器,很明显可以在多个检测器中测量发射的光子。这如图 2 所示。第二个检测器存在光谱重叠的事实,有必要进行补偿,这允许研究人员在存在多种荧光染料的情况下识别单个阳性。您可以在另一篇博客中阅读相关内容。

图 2:未补偿和补偿的 FITC 单染色对照。

  图 2:未补偿和补偿的 FITC 单染色对照。

  多色流式细胞仪的后果之一是数据会传播,如果没有适当的控制,设置阳性变得困难。这就是为什么建议使用荧光减一 (FMO) 作为建立正确门控的方法的原因。FMO 对照是用除一种以外的所有荧光染料染色的样品。这在下面的图 3 中显示。

图 3:使用 FMO 设置正门。

  图 3:使用 FMO 设置正门。

  在左侧面板上,我们有完整的未染色细胞。红色虚线表示阴性和阳性细胞之间的边界。右面板是完全染色的样品。中间面板显示了 PE FMO 对照——该样品被除 PE 之外的所有荧光染料染色。请注意此示例中红线上方的事件。由于该样本没有 PE 标签,因此这些细胞不能是阳性细胞。因此,设置正边界的适当位置显示在绿线中。红线和绿线之间的括号是所谓的数据分布。

  在尝试识别罕见事件、模糊标记或紧急抗原的情况下,FMO 控制是必不可少的控制。通过适当使用此控件,设置正门很简单。它解决了与作为多色流式细胞术一部分的光谱溢出相关的问题。因此,当您设计实验时,不要忘记将 FMO 添加到正确分析所需的关键控制列表中。

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