经常有小伙伴对于免疫荧光（IF）的诸多问题不知所措，下面是一些免疫荧光（IF）的常见问题及优化方案详细解答，给受困于免疫荧光（IF）的同胞们谋个福利~

　　常见问题一：信号弱或无信号，染色细胞过少

　　可能原因：

　　1.目标蛋白在细胞中没有表达

　　2.表达目标蛋白的细胞过少

　　3.细胞通透性差

　　4.染色前的固定步骤破坏了抗原表位

　　5.通透使抗原丢失

　　6.抗体不识别

　　7.一抗稀释度过大

　　8.二抗选择错误

　　优化方案（与以上原因相对应）：

　　1.制备细胞裂解液，用Western Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达

　　2.标本中使用更多的细胞，试用其他瞬时转染方法，或者使用稳定转染细胞系

　　3.增加通透剂作用的时间或者浓度，或改用其它的通透剂

　　4.改用其他固定方法

　　5.减少通透剂作用的时间或强度

　　6.换用其他抗体

　　7.同一样品按zui佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定zui佳的一抗稀释比例

　　8.使用正确的二抗

　　常见问题二：背景过高

　　可能原因：

　　1.一抗质量不高

　　2.一抗浓度太高

　　3.二抗浓度太高

　　4.封闭不完全

　　5.封闭液BSA中含IgG

　　6.洗涤不充分

　　优化方案（与以上原因相对应）：

　　1.使用特异性高，效价高的一抗

　　2.同一样品按zui佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定zui佳的一抗稀释比例

　　3.同一样品按zui佳的一抗用量作二抗稀释曲线，以确定zui佳的二抗稀释比例

　　4.使用二抗来源动物的非免疫血清进行封闭；改善封闭条件

　　5.使用高纯度（IgG free）的BSA

　　6.充分洗涤

　　常见问题三：细胞呈扁平状

　　可能原因：

　　1.细胞片被风干

　　2.使用了甲醇固定

　　优化方案（与以上原因相对应）：

　　1.在任何时候都不要让细胞片干燥；使用湿盒

　　2.甲醇可破坏细胞膜，因此不能很好保持细胞形态。改用甲醛或戊二醛等其他固定剂

　　常见问题四：细胞有自发荧光

　　可能原因：

　　1.使用了戊二醛固定

　　2.材料本身（如石蜡）有自发荧光

　　优化方案：

　　在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光

　　常见问题五：细胞模糊，封片剂明亮

　　可能原因：

　　1.因洗涤不充分导致背景太亮

　　2.二抗结合太弱

　　优化方案（与以上原因相对应）：

　　1.充分洗涤

　　2.确保抗体牢固结合，确保固定良好

　　常见问题六：整个细胞片都出现荧光亮点

　　可能原因：

　　1.二抗浓度过高

　　2.二抗发生沉淀

　　优化方案（与以上原因相对应）：

　　1.降低二抗浓度

　　2.过滤或离心荧光标记二抗

　　以上一共提供了6个常见问题及相应优化方案，相对来说比较简单，更好的实验结果还是要同志们再次实验尝试的，其中实验试剂的品质也是非常重要的一个环节。比如说，正常驴血清就是一个非常典型的实验试剂，很多热门研究领域都在使用，大家也可以根据相应问题找到适合自己的实验试剂。