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免疫荧光(IF)正常驴血清解决方案

2022-05-05 10:34:28
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  经常有小伙伴对于免疫荧光(IF)的诸多问题不知所措,下面是一些免疫荧光(IF)的常见问题及优化方案详细解答,给受困于免疫荧光(IF)的同胞们谋个福利~

  常见问题一:信号弱或无信号,染色细胞过少

  可能原因:

  1.目标蛋白在细胞中没有表达

  2.表达目标蛋白的细胞过少

  3.细胞通透性差

  4.染色前的固定步骤破坏了抗原表位

  5.通透使抗原丢失

  6.抗体不识别

  7.一抗稀释度过大

  8.二抗选择错误

  优化方案(与以上原因相对应):

  1.制备细胞裂解液,用Western Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达

  2.标本中使用更多的细胞,试用其他瞬时转染方法,或者使用稳定转染细胞系

  3.增加通透剂作用的时间或者浓度,或改用其它的通透剂

  4.改用其他固定方法

  5.减少通透剂作用的时间或强度

  6.换用其他抗体

  7.同一样品按zui佳的二抗用量作一抗稀释曲线,以确定zui佳的一抗稀释比例

  8.使用正确的二抗

免疫荧光

  常见问题二:背景过高

  可能原因:

  1.一抗质量不高

  2.一抗浓度太高

  3.二抗浓度太高

  4.封闭不完全

  5.封闭液BSA中含IgG

  6.洗涤不充分

  优化方案(与以上原因相对应):

  1.使用特异性高,效价高的一抗

  2.同一样品按zui佳的二抗用量作一抗稀释曲线,以确定zui佳的一抗稀释比例

  3.同一样品按zui佳的一抗用量作二抗稀释曲线,以确定zui佳的二抗稀释比例

  4.使用二抗来源动物的非免疫血清进行封闭;改善封闭条件

  5.使用高纯度(IgG free)的BSA

  6.充分洗涤

  常见问题三:细胞呈扁平状

  可能原因:

  1.细胞片被风干

  2.使用了甲醇固定

  优化方案(与以上原因相对应):

  1.在任何时候都不要让细胞片干燥;使用湿盒

  2.甲醇可破坏细胞膜,因此不能很好保持细胞形态。改用甲醛或戊二醛等其他固定剂

  常见问题四:细胞有自发荧光

  可能原因:

  1.使用了戊二醛固定

  2.材料本身(如石蜡)有自发荧光

  优化方案:

  在固定后荧光染色前进行荧光淬灭,如使用NaIO4,NaBH4,甘氨酸等,染色前检查自发荧光

  常见问题五:细胞模糊,封片剂明亮

  可能原因:

  1.因洗涤不充分导致背景太亮

  2.二抗结合太弱

  优化方案(与以上原因相对应):

  1.充分洗涤

  2.确保抗体牢固结合,确保固定良好

  常见问题六:整个细胞片都出现荧光亮点

  可能原因:

  1.二抗浓度过高

  2.二抗发生沉淀

  优化方案(与以上原因相对应):

  1.降低二抗浓度

  2.过滤或离心荧光标记二抗

  以上一共提供了6个常见问题及相应优化方案,相对来说比较简单,更好的实验结果还是要同志们再次实验尝试的,其中实验试剂的品质也是非常重要的一个环节。比如说,正常驴血清就是一个非常典型的实验试剂,很多热门研究领域都在使用,大家也可以根据相应问题找到适合自己的实验试剂。


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