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流式细胞样品制备(流式细实验如何制备流式样品)

发布时间:2022-03-15 10:36:10 阅读:16452次 来源:医学科研小坑

  流式细胞仪检测分析的对象是细胞或者细胞样颗粒性物质,所以流式细胞术是细胞学的重要研究手段之一。而如何准备合格的样品是包装实验数据准确的基础,下面就讲一下如何制备流式样品。

流式细胞样品制备(流式细实验如何制备流式样品)

  独立细胞样品制备

  如果研究对象是体外培养的悬浮细胞,则直接收集细胞于离心管中,离心沉淀细胞,然后用PBS重悬沉淀,取适量细胞于离心管中,标记相应的荧光素偶联抗体,最后洗去未结合的抗体,用流式PBS重悬细胞于流式管中,则可上样分析样品细胞。如果该培养细胞是贴壁细胞,需用胰酶消化细胞适当时间后,用移液器反复吹打,收集待测样品细胞,离心后标记荧光素偶联抗体即可。

  如果研究对象是外周血,根据目标细胞的不同可以有两种处理方法。如果研究对象是外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcl,PBMC),最常用的提取方法是Ficoll-hypague密度梯度离心法Ficoll-hypague密度梯度离心法分离PBMC:

  (1)抽取适量的血液于离心管中,该离心管必须事先加上抗凝剂,防止血液凝固。

  (2)用PBS稀释血液,稀释倍数可以根据血液的浓稠度加以调整,一般以2-4倍为宜。

  (3)根据稀释后血液的总量选用15ml离心管或者50ml离心管,先加入离心管1/4左右体积的Ficoll分离液,然后慢慢将稀释后的血液小心叠加到Ficoll分离液的上层,体积是 Ficoll液体积的2.5-3倍为宜。注意叠加血液时一定要轻柔,避免加入的血液与Ficoll液相混合,这一步很关键,如果血液层与Ficoll液层互相混合,就无法成功分离PBMC。

  (4)将离心管在水平离心机中离心,中速离心30min。

  (5)取出离心管,此时离心管内的液体分为三层,如图所示,上层为血浆,中层为含有PBMC的 Ficoll液,最下层为红细胞,注意此时要轻拿轻放,切勿将分层的液体重新混合。PBMC主要位于 Ficoll液的上层,即血浆层与 Ficoll液层的交界处,肉眼见到的混浊絮状物就是PBMC,用吸管小心吸取中层的 Ficoll液,尽量吸尽其中的混浊絮状物,吸入少量血浆不会影响结果,但需避免吸入最下层的红细胞

图例

  (6)将得到的含有PBMC的中层Ficoll分离液置于新的离心管中用PBS稀释,至少稀释一倍。此PBS稀释步骤必不可少,如果不经PBS稀释直接离心,则离心时无法有效沉淀PBMC,因为PBMC密度小于Ficoll,不稀释直接离心时PBMC仍将位于Ficoll分离液上层。

  (7)低速离心10min,使PBMC沉淀,而血小板悬浮于上层液体中弃去含有血小板的上层液体。如果血小板去除不满意,可以重复低速离心一次。

  (8)用PBS重悬PBMC沉淀,中速离心5min,沉淀即为PBMC。

  如果研究对象是包括多核粒细胞的外周血白细胞,就不能用Ficoll-hypaguea密度梯度离心法,因为该法会同时去除多核粒细胞和红细胞。这时可以采取直接用红细胞裂解液裂解红细胞的方法,然后多次低速离心去除红细胞碎片即可。

  收集人的外周血方法比较简单,直接静脉采血,收集于抗凝管中即可。

  收集小鼠的外周血最常用的方法是眼眶取血法:常规麻醉小鼠用弯镊钳住小鼠的一侧眼球,轻轻将眼球连同眼球后的血管一起拉出,用力摘除眼球,倒置小鼠,将眼眶部位对准收集管,血液会自动从小鼠眼眶部位流出,流速慢时可以适当挤压小鼠心脏部位

  。

  如果研究对象是胸水、腹水、脑脊液等体液内的细胞,只需直接将体液标本离心,弃上清,用PBS重悬沉淀,就可以标记荧光素偶联抗体然后进行流式上样分析。

  免疫器官样品制备

  免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官,中枢免疫器官是免疫细胞发育的场所,主要包括骨髓和胸腺,外周免疫器官是免疫细胞发挥功能的场所,主要包括脾脏和淋巴结。免疫器官主要由免疫细胞组成,免疫细胞之间基本是相互独立的,很少形成稳定的连接,而且免疫器官内结缔组织含量也比较少,所以将免疫器官制备成单细胞悬液相比于其他实体脏器要容易得多。

  研究小鼠的骨髓细胞一般提取长骨如股骨和胫骨内的骨髓

  骨髓单细胞悬液制备方法:

  (1)颈椎脱臼处死小鼠,用剪刀、镊子直接分离小鼠的股骨和胫骨。

  (2)用1ml的注射器在股骨或胫骨的两端钻孔,然后用该注射器吸取培养基,反复冲洗股骨和胫骨的骨髓腔,将骨髓腔内的细胞冲洗出来。

  (3)用枪头或者移液管反复吹打冲洗液中的骨髓细胞,使骨髓细胞尽可能相互分离,成为单细胞悬液。

  (4)离心沉淀骨髓单细胞悬液,红细胞裂解液裂解红细胞。

  (5)离心弃上清,去除红细胞碎片。

  (6)用PBS重悬沉淀,就可以进行后续荧光素偶联抗体标记,然后进行流式上样分析。

  胸腺、脾脏和淋巴结内主要是相对独立的免疫细胞,制备这些脏器的单细胞悬液,只需直接将脏器经钢网研磨即可。

  胸腺、脾脏和淋巴结单细胞悬液制备方法:

  (1)颈椎脱臼处死小鼠,分离需要制备单细胞悬液的脏器。

  (2)取一干净平皿,放入钢网,将脏器置于钢网上,加入适量PBS或者培养基。用硏磨棒轻轻硏磨脏器,尽量将所有脏器组织研磨成单细胞状态,直到只剩下脏器的结缔组织为止。注意研磨时动作应轻柔,用力过大可导致细胞死亡。

  (3)弃去钢网和钢网上的结缔组织,收集平皿内的细胞悬液,离心沉淀。

  (4)红细胞裂解液裂解红细胞,离心去除红细胞碎片。

  (5)用PBS重悬沉淀,就可以标记荧光素偶联抗体,然后进行流式上样分析。

  实体脏器样品制备

  实体脏器如肺脏、肝脏和胂瘤组织内含有较多的结缔组织,实体脏器细胞之间一般结合紧密,所以直接研磨脏器法无法得到理想的单细胞悬液。因此,研磨前需将脏器剪碎后加入Ⅳ型胶原酶消化,消化后的组织再用研磨棒直接硏磨,以后的步骤与免疫器官样品制备相同。

  Ⅳ型胶原酶消化脏器的最佳时间各不相同:肝脏组织较脆,结缔组织含量相对较少,一般消化0.5-1h肺脏组织较韧,完全消化大约需3h;肿瘤组织根据组织类型的不同而异,一般需1-2h实体脏器硏磨后的单细胞悬液以实体细胞为主,如果研究目标不是实体细胞,而是脏器内浸润的免疫细胞,可以用Percoll密度梯度离心法富集免疫细胞,然后再进行流式分析。

  在制备单细胞悬液的过程中,尤其是在制备粘连性较大的实体脏器的单细胞悬液的过程中,如人的肿瘤组织等,经常会在缓冲液中加入EDTA等阳离子螯合剂以防止单细胞再聚集。EDTA等在防止单细胞再聚集方面有较好的作用,但它可能会影响实验结果,如EDTA会螯合缓冲液中的钙离子,大幅度减弱荧光素偶联的抗人CD8单抗的荧光信号,若同时加入CaCl2可有助于抵消EDTA对抗体荧光信号的影响。因此,研究者应该严格比较加入EDTA组与不加EDTA组的实验结果,排除EDTA对实验结果的影响。

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