RNA分离原理

　　用称为 Trizol 的溶液提取后，从 DNA 和蛋白质中分离和分离总RNA 。Trizol 是一种酸性溶液，含有硫氰酸胍 (GITC)、苯酚和氯仿。GITC 不可逆地使蛋白质和 RNase 变性。这之后是离心。在酸性条件下，总 RNA 保留在上层水相中，而大部分 DNA 和蛋白质保留在中间相或下层有机相中。然后通过用异丙醇沉淀来回收总 RNA。RNase 酶可以通过加入焦碳酸二乙酯 (DEPC) 来灭活。

　　RNA 分离所需的材料

　　细菌培养

　　三唑

　　氯仿

　　异丙醇溶液

　　TAE 缓冲液

　　70% 乙醇

　　RNA分离程序

　　在新鲜的 eppendorf 中取 800 μL 的细菌培养物。

　　为此添加 160 μL Trizol（培养体积的 1/5）。

　　通过移液数次将溶液充分混合。

　　向其中加入 32 μl 氯仿（三唑的 1/5 体积）。

　　孵育 2 至 5 分钟并在 4°C 下以 12000 rpm 离心 15 分钟

　　将水相转移到新管中并加入等体积的异丙醇。搅拌均匀。

　　在 4°C 下以 10000 rpm 离心 10 分钟。

　　丢弃上清液并将颗粒重新悬浮在 70% 乙醇中。• 再次在 4°C 下以 10000 rpm 离心 10 分钟。

　　弃去上清液。

　　将颗粒在 37°C 下风干 10-15 分钟。

　　将颗粒重新悬浮在 50 μL 的 TE 缓冲液中。

　　定量和定性分析 RNA 样品。

　　从动物细胞或组织中分离 RNA

　　材料试剂

　　三唑试剂

　　氯仿

　　仪器

　　通风柜

　　涡流器

　　微量移液器

　　冷冻微量离心机

　　颗粒杵均质机

　　程序

　　使用破坏 RNase 的表面去污溶液清洁工作站（移液器轴、工作台）。

　　将微量离心机冷却至 4 ºC。

　　均质新鲜组织或细胞培养：

　　新鲜组织更适合最佳 RNA 分离。或者，组织应在解剖后立即浸入 RNA 稳定试剂中并储存在 –80 °C。

　　每 100 mg 新鲜组织加入 1 ml TRIzol 试剂，用无菌手术刀在冰上切碎，并用无菌颗粒杵探针匀浆。

　　如果是细胞培养物，应在从培养箱中取出后立即进行处理。

　　在室温 (15-25 ºC) 下以 300 xg 的速度将悬浮生长的细胞离心 5 分钟，然后弃去上清液或从单层生长的细胞中除去培养基。

　　每 1 × 10 7 个细胞加入 1 ml TRIzol 试剂到细胞沉淀中，或直接加入培养皿或烧瓶中以培养单层细胞。用无菌的一次性 1-ml 移液器吸头重悬裂解液。

　　将组织或细胞裂解物转移到 2 ml 硅化低保留管中。

　　将样品通过无菌的一次性 21 g 针头 10 次。在此过程中，高分子量细胞成分 (DNA) 被碎片化，从而最大限度地减少它们在水相中的存在。

　　让匀浆在 RT (15-25 ºC) 下放置 5 分钟，以完全解离核蛋白复合物。

　　让匀浆在 RT (15-25 ºC) 下静置 3 分钟。

　　在 4°C 下以 12,000 xg 离心 15 分钟。离心后，将离心机加热至室温 (15–25°C)。

　　将上层水相 (600 ul) 转移到新的 1.5 ml 无 RNase 管中。

　　进行酒精沉淀。

　　通过与异丙醇混合从水相中沉淀 RNA。每 1 ml TRIZOL 试剂使用 0.5 ml 异丙醇用于初始均质化。

　　将样品在 15 至 30oC 下孵育 10 分钟，然后在 2 至 4oC 下以不超过 12,000 xg 的速度离心 10 分钟。

　　完全去除上清液。用 75% 乙醇清洗 RNA 沉淀一次，每 1 ml 用于初始均质化的 TRIZOL 试剂至少加入 1 ml 75% 乙醇。

　　通过涡旋混合样品并在 2 至 8 oC 下以不超过 7,500 xg 的速度离心 5 分钟。重复。

　　风干或真空干燥 RNA 沉淀 5-10 分钟。

　　将溶液通过移液器吸头几次，将 RNA 溶解在 DEPC 处理过的水中。

　　经分光光度分析确定样品浓度和纯度。

　　预期成绩

　　RNA 沉淀管的侧面和底部有凝胶状沉淀。

　　在 260 nm 和 280 nm 处取 OD，A260/A280 比值应高于 1.6。