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蛋白质印迹的要求(Western Blot结果解读)

发布时间:2022-01-15 10:27:18 阅读:17672次 来源:百度学术

  蛋白质印迹,也称为免疫印迹,是在复杂的生物样品中分离蛋白质并鉴定它们的过程。

  使用聚丙烯酰胺凝胶电泳是进行蛋白质印迹的先决条件,以便在识别蛋白质之前对其进行分离。

  蛋白质印迹的过程涉及将 SDS PAGE分离的蛋白质转移到吸收膜中。然后可以通过不同的方式在膜上识别蛋白质。

  通过使用针对膜结合蛋白的抗体探针,蛋白质印迹彻底改变了免疫学领域。

  蛋白质的免疫检测在生物化学和其他科学中有广泛的应用,因为它可以检测和表征多种蛋白质。

  该过程的灵敏度取决于蛋白质在处理和最终检测过程中的转移保留效率。

  蛋白质印迹或蛋白质印迹取决于目的蛋白质与用于检测蛋白质的探针之间相互作用的特异性。

  与使用放射性标记的核酸探针的 Southern 印迹不同,蛋白质印迹通常使用带有酶标记的二抗。

  与其他类似技术相比,Western 印迹具有许多优势,因为该过程只需要使用少量试剂,并且相同的蛋白质转移可用于多种分析。

  免疫印迹原理

  蛋白质印迹的原理是蛋白质与用于检测蛋白质的探针之间的相互作用。

  用于蛋白质印迹的蛋白质通过凝胶电泳分离以在凝胶基质上获得它们。

  然后将蛋白质转移到硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上,并在其中固定。蛋白质的转移称为印迹。

  膜上的蛋白质可以通过使用针对蛋白质的报告标记的一抗或针对一抗的报告标记的二抗来检测。

  抗体上存在的报道分子或探针可以是在存在特定底物的情况下产生荧光信号的抗原-抗体结合位点产生颜色反应或发光信号的酶。

  探针产生的信号或颜色需要适合产生的信号或强度的检测系统。

  蛋白质印迹的要求

  凝胶电泳

  凝胶(NuPAGE)

  基本电源

  样品缓冲液

  加热块

  样品还原缓冲液

  预染蛋白阶梯

  蛋白质转移

  Mini Trans-Blot 由一个槽、盖子和一个印迹模块组成。该组件与冷却冰一起储存,以便在需要时将其冷冻。

  0.45 µm 硝酸纤维素滤纸

  NuPAGE 转移缓冲液

  甲醇

  方形耐热玻璃盘

  方形一次性塑料培养皿

  剃须刀和凝胶刀

  基本电源

  蛋白质印迹

  10x Tris 缓冲盐水,含 1% Tween 20。

  摇床

  10% 脱脂奶粉

  方形一次性塑料培养皿

  塑料袋

  脉冲热封机

  一抗

  二抗与辣根过氧化物酶偶联,针对一抗的宿主物种。

  化学发光底物

  凝胶文件系统

  蛋白质印迹程序

  蛋白质印迹的过程包括以下步骤;

  1. 样品制备

  最常用的蛋白质印迹样品是通过提取过程收集的细胞裂解物。

  提取可以通过不同的方式实现,例如机械破坏、化学提取或使用酶。

  提取通常在蛋白酶抑制剂存在下在低温下进行,以防止蛋白质变性。

  2. 凝胶电泳

  蛋白质样品用样品缓冲液稀释,并在 70°C 下加热并摇动 10 分钟。

  然后以 5000g 离心样品。

  凝胶盒从袋中取出,放在缓冲罐中,靠着橡胶密封件,凝胶壁面向罐槽的内部。

  将运行缓冲液倒入上层容器中,同时确保下层容器不会发生缓冲液泄漏。

  然后在每个孔中装入等体积的热变性样品,其中一条通道保留用于蛋白质阶梯。

  盖子放在水箱上,并连接到电源。

  允许运行在 200 V 恒定电压下运行 50 分钟。

  3. 蛋白质转移

  通过向缓冲液中加入 10% 甲醇制备转移缓冲液。

  分动箱被拿走并布置。然后用传输缓冲器覆盖它。

  取出泡沫海绵并将其放在背面,滤纸在其上方。应放置这些以确保它们都湿润并略微浸没。

  从罐中取出凝胶并放在湿滤纸上。

  硝酸纤维素膜被转移缓冲液润湿,并以凝胶和膜之间没有气泡的方式放置在凝胶顶部。

  转移箱被放入转移罐中,进一步填充转移缓冲液。

  然后将油箱连接到 100V 电源 1 小时。

  转移完成后,移除转移箱,并从凝胶中移除硝酸纤维素膜。

免疫检测

  4. 免疫检测

  在培养皿中用 Tris 缓冲盐水洗涤膜 5 分钟。

  将 10% 脱脂奶粉与 Tris 缓冲液混合,在室温下用混合物覆盖膜 30 分钟。

  用 Tris 缓冲液洗涤膜以去除残留在膜上的任何多余混合物。

  在镊子的帮助下,将膜转移到一个新的培养皿中,在培养皿上添加一抗。

  带有抗体的膜在室温下孵育 3 小时。用 Tris 缓冲液孵育后洗涤膜。

  将膜再次转移到新的培养皿中,在其中添加 HRP 偶联的二抗。将膜孵育 1 小时。二抗的浓度通常保持在 1 µg/ml,但这也取决于稀释度。

  再次用 Tris 缓冲液洗涤膜以从表面去除多余的抗体。

  将膜与底物一起孵育 5 分钟,然后进行观察。

  Western Blot结果解读

  蛋白质印迹的结果取决于过程中使用的探针类型。

  如果使用酶联二抗,底物和酶之间的反应会产生颜色。

  可溶性染料转化为不溶性形式,从而在膜上产生不同的颜色。

  为了阻止印迹的发展,通过洗涤膜去除染料。

  然后可以通过分光光度法评估蛋白质水平。

  蛋白质印迹的应用

  蛋白质印迹法是一种具有高灵敏度的优秀方法,即使在少量时也能检测到特定的蛋白质。

  Western印迹已用于不同疾病的临床诊断。HIV 的确认测试包括通过检测血清中的抗 HIV 抗体进行蛋白质印迹。

  该技术已用于量化基因表达研究中的蛋白质和其他基因产物。

  由于蛋白质印迹通过蛋白质的大小和与抗体结合的能力来检测蛋白质,因此它适用于评估细胞中的蛋白质表达并在蛋白质纯化过程中进一步分析蛋白质组分。

  蛋白质印迹也用于分析不同的生物标志物,如生长因子、细胞因子和激素。

  蛋白质印迹的局限性

  由于这是一个非常敏感的过程,过程中的任何不平衡都会影响整个过程的结果。

  在某些情况下,由于蛋白质的转移不足,可能没有观察到条带或错误的条带。

  该测试只能用作半定量测试,因为估计并不总是精确的。

  该过程耗时且复杂,因此只能由训练有素的人员执行。

  只有当蛋白质的一抗可用时,才能对蛋白质进行蛋白质印迹。

  一些抗体可能会通过与样品中的一种以上蛋白质相互作用而表现出脱靶效应。

  该技术是一个昂贵的过程,具有抗体成本和昂贵的检测方法。

  小蛋白质可能不会被膜保留,而较大的蛋白质难以转移到膜上。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/726.html

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