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Eastern blot原理(蛋白质印迹的应用)

2022-01-15 10:50:23
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  Eastern Blot是一种分子生物学技术,用于检测蛋白质的翻译后修饰以及脂质和碳水化合物等成分的存在。

  Eastern Blot被发现是更流行的蛋白质印迹技术的延伸。

  Eastern Blot主要用于检测不同蛋白质中生物分子的存在,可用于研究不同物种翻译后修饰的差异。

  该方法的原理和程序在所有印迹技术中都是相似的;但是,要检测的分子或粒子可能会有所不同。

  Eastern Blot经过略微修改,形成了一种称为远西方印迹的新形式的印迹技术,用于研究通过色谱分离的脂质。

Eastern blot原理

  蛋白质印迹原理

  Eastern Blot的原理与其他印迹技术的原理相似。

  它是一种免疫印迹技术,它依赖于感兴趣的蛋白质和探针之间的特异性,以便在不同分子的混合物中识别感兴趣的生物分子。

  在Eastern Blot的情况下,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳,以便将它们从混合物中分离出来。

  然后将蛋白质转移到硝酸纤维素或尼龙膜上,通过它们与探针的特异性相互作用来检测目标分子。

  可以通过使用放射性探针或通过使用二级标记分子(如ELISA的情况)来确定相互作用。

  与所有其他印迹技术一样,Eastern 印迹技术基于抗原-抗体相互作用,其中相互作用的特异性和程度决定了结果。

  Eastern Blot类似于凝集素印迹,因为它们都主要用于检测蛋白质和脂质上的碳水化合物表位。

  使用免疫印迹法检测小分子化合物是必不可少的,因为免疫染色无法检测这些分子。

  要求

  以下是Eastern Blot的要求;

  薄层色谱板

  转移膜

  NaIO 4溶液

  印迹溶液

  Na 2 CO 3 / NaHCO 3不锈钢板

  蛋白质印迹程序

  以下是Eastern Blot的协议;

  色谱后显影的 TLC 板用 PVDF 膜覆盖,以便通过加压或加热将内容物从板转移到膜上。

  也可以通过使电流通过结构来实现成分从 TLC 板到膜的转移。

  然后用高碘化钠处理膜以将组分固定在膜上。将其在溶液中孵育 1 小时并用水洗涤。

  将膜浸入碱性条件下的BSA溶液(Na 2 CO 3 /NaHCO 3缓冲液)中,在膜上制备半抗原-BSA缀合物。

  用 5% 脱脂牛奶/PBS 封闭 3 小时,然后用 PBS 洗涤。膜由检测半抗原的 MAb 处理。

  MAb 和半抗原之间的相互作用形成了用于检测其的Eastern Blot的基础。

  然后可以通过添加用过氧化物酶标记的第二抗体来检测 MAb。

  最后,将底物添加到膜上,这有助于通过染色显示二抗。

  结果解释

  Eastern Blot的结果取决于二抗中使用的标记类型。

  颜色或放射性的出现表明阳性结果。

  阴性结果由缺乏颜色或放射性表示。

  蛋白质印迹的应用

  Eastern Blot最重要的应用是分析蛋白质的翻译后修饰。

  该技术已被用于识别和纯化不同的植物产品。

  Eastern Blot还允许检测不同来源的蛋白质的修饰。

  它还有助于通过使用配体来研究不同分子之间相互作用的性质。

  Eastern Blot已广泛用于比较从不同细菌物种获得的蛋白质的修饰。

  它还用于检测不同蛋白质中的碳水化合物表位。

  Eastern Blot的局限性

  该技术很复杂,并且包含多个容易出错的步骤。它还需要经过培训的人员才能使用。

  该技术需要使用大量样品,这在产量很少的生产情况下可能是一个问题。

  蛋白质和生物分子的准确定量很难用Eastern印迹法进行。

  在某些情况下,探针和生物分子之间的相互作用可能会导致蛋白质三级结构的破坏。

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