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Southern印迹原理原理(Southern Blot结果解读)

2022-01-15 10:22:44
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  Southern印迹是将通过电泳分离的DNA片段转移到膜上以进行固定和鉴定的过程。

  Southern 印迹已被用作分析不同应用的 DNA 样品的常规程序。

  该技术是由 Edwin Southern 发现的,并以他的名字命名。该技术后来产生了其他技术,如基于相同原理的蛋白质印迹和北方印迹。

  该技术的最基本形式用于从复杂的基因组 DNA 混合物中确定 DNA 片段的大小。

  该技术也是相对定量的,可用于确定基因组中存在的片段的拷贝数。

  Southern Blotting 可以根据膜、转移缓冲液和方法的选择进行修改。最常用的膜是硝酸纤维素膜,因为它很坚固并且可以多次重复探测。

  同样,Southern 印迹的原始方案使用放射性探针。然而,其他使用荧光和化学发光的标记系统。

  为了更好地服务于应用程序,Southern 印迹已进行了多种修改,并且变得更加复杂和高效。

  Southern印迹的原理

  Southern印迹的原理类似于将生物分子从膜转移到另一膜以进行检测和鉴定的印迹技术。

  待分析的 DNA 用限制性内切酶消化,并通过琼脂糖凝胶电泳过程按大小分级。

  DNA 链通过碱处理变性,并通过印迹过程转移到尼龙或硝酸纤维素膜上。

  膜上的链通过烘烤或紫外线照射固定在表面上。可以通过杂交过程检测膜上的DNA序列。

  杂交反应是特异性的,因为使用的探针与由互补序列组成的目标片段结合。

  使用的探针标有不同的成分,可以通过不同的方法可视化,具体取决于所用探针的类型。

Southern印迹

  要求

  设备

  水浴

  琼脂糖凝胶

  电源供应

  紫外线辐射

  杂交炉

  杂交瓶

  托盘

  胶片处理器

  移液器

  离心管

  玻璃盘

  Whatman 3 毫米色谱纸

  尼龙膜/硝酸纤维素膜

  注射器

  醋酸纤维素膜

  材料

  限制性酶

  限制酶缓冲液

  琼脂糖

  TBE 缓冲液

  DNA上样缓冲液

  三碱基

  氯化钠

  氢氧化钠

  柠檬酸钠

  DNA标记试剂盒

  核酸检测试剂盒

  十二烷基硫酸钠 (SDS)

  聚乙烯吡咯烷酮

  牛血清白蛋白

  甲酰胺

  苯酚

  溶液和缓冲液

  变性缓冲液:NaOH 和 NaCl 比例为 1:6

  中和缓冲液:Tris-HCl 和 NaCl,比例为 5:3

  SSC:将 175.3 g NaCl 和 88.2 g 柠檬酸钠加到 1L 蒸馏水中。

  检测缓冲液:Tris-HCl 和 NaCl,比例为 5:1。

  Southern Blot的程序

  一个。DNA的限制性消化

  大约 10 µg 提取的基因组 DNA 在微量离心管中用适当的限制酶消化。

  将试管在 37°C 下孵育过夜。在某些情况下,在孵育后将管在 65°C 的水浴中加热 20 分钟以使限制性内切酶变性。

  向试管中加入 10μl DNA 样品缓冲液,将混合物倒在琼脂糖凝胶上进行电泳。

琼脂糖凝胶上进行电泳

  电泳

  凝胶的百分比和大小取决于要分离的 DNA 片段的大小。然后相应地制备凝胶。

  用溴化乙锭制备电泳缓冲液,并以高于凝胶支持物几毫米的方式倒入槽中。

  凝胶铸件与带有齿的梳子一起制备,以形成可以容纳样品体积的孔。一旦梳子就位,凝胶就会慢慢倒入模型中。

  凝胶凝固后,取下梳子,将凝胶放在水箱上。

  将运行缓冲液添加到罐中以覆盖凝胶。

  通过添加上样缓冲液制备样品并小心地移液到孔中。

  水箱连接到电源并允许运行过夜。

  C。变性

  将凝胶从电泳装置中取出,置于装有 500 ml 变性缓冲液(1.5 M NaCl 和 0.5 M NaOH)的玻璃盘中,在室温下放置 45 分钟。

  倾倒变性缓冲液并用中和缓冲液替换。让凝胶浸泡 1 小时,同时在平台旋转器上缓慢旋转。

  d。印迹

  将比凝胶稍大的长方形海绵放在装有 SSC 的玻璃盘上,使浸泡过的海绵大约一半浸没在缓冲液中。

  将三张 Whatman 3mm 纸剪成与海绵相同的尺寸。将它们放在海绵上并用 SSC 润湿。

  将凝胶放在滤纸上并通过在表面上滚动玻璃移液管挤出以去除气泡。

  将刚好足以覆盖凝胶表面的尼龙膜放置在凝胶顶部。膜进一步充满 SSC,并在其顶部放置几张滤纸。

  最后,在结构顶部放置一块玻璃板以将所有东西固定到位。允许 DNA 转移过夜。

  e. 烘烤/固定

  将尼龙膜从印迹结构中取出并连接到真空或 80°C 的常规烘箱中 2-3 小时。

  膜上的 DNA 链也可以通过将膜暴露于紫外线辐射来固定。

  F。杂交

  膜暴露于杂交探针,该探针可以是 DNA 片段或具有检测目标 DNA 的特定序列的 RNA 片段。

  探针核酸被标记,以便可以通过结合放射性或用荧光或显色染料标记分子来检测它。

  过程中的条件以探针与膜上的互补序列杂交的方式选择。

  杂交之后用缓冲液洗涤以去除非特异性结合或保持未结合的探针,从而只有标记的探针保持与靶序列结合。

  G。检测

  通过将尼龙膜与照相胶片接触,可以通过放射自显影检测膜上的杂交区域。

  图像显示了杂交 DNA 分子的位置,可通过将它们与已知长度的标记 DNA 分子进行比较来确定片段的长度。

  同样,图像还提供了有关杂交片段数量及其大小的信息。

  如果使用荧光染料或显色染料,则可以在 X 射线胶片上或通过膜上的显色来观察这些染料。

  Southern Blot结果解读

  Southern印迹的结果以膜上条带的形式观察到。DNA 片段的大小可以通过将它们的相对大小与已知长度的 DNA 条带进行比较来确定。

  Southern Blot 的应用

  Southern印迹在基因发现、作图、进化和诊断研究领域有许多应用。

  该技术可用于 DNA 分析,以检测 DNA 序列中的点突变和其他结构重排。

  该方法还允许确定限制性片段的分子量,这有助于分析这些片段。

  由于该技术能够检测特定的 DNA 片段,因此可以通过指纹识别用于个人识别。

  它可用于疾病诊断以及遗传疾病的产前诊断。

  Southern Blot 的局限性

  该方法成本高,因为与其他测试相比,它需要昂贵的设备和试剂。

  这是一个由多个步骤组成的复杂过程。该过程也是劳动密集型的,需要训练有素的人员。

  这是一个耗时的过程,可以用聚合酶链式反应等其他更快的过程代替。

  这是一个半定量过程,仅提供 DNA 片段的估计大小。

  Southern 印迹不是检测碱基对水平突变的合适方法。

  样品需要通过卓越的分离方法获得大量样品和更高质量的 DNA。

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