资讯动态

Northern印迹定义原理与步骤(Northern印迹结果解读)

2022-01-15 10:18:33
|
访问量:138432

  Northern印迹是一种基于印迹原理的技术,用于分析复杂混合物中的特定RNA。

  该技术是Southern Blotting的改进版本,它是为分析 DNA 序列而发现的。

  从不同类型的生物样品中提取的某些核酸序列的检测在分子生物学中是必不可少的,这使得印迹技术在该领域势在必行。

  原理与Southern印迹相同,除了用于检测的探针,因为Northern印迹检测RNA序列。

  该技术提供有关 RNA 序列长度和序列中是否存在变异的信息。

  尽管该技术主要集中在 RNA 序列的识别上,但它也被用于 RNA 序列的量化。

  自从发现该技术以来,已经对该技术进行了一些修改,用于分析 mRNA、pre-mRNA 和短 RNA。

  长期以来,Northern印迹法作为分析RNA片段的主要技术。然而,RT-PCR 等新的、更方便且更具成本效益的技术已经慢慢取代了该技术。

Northern印迹

  Northern印迹原理

  Northern印迹的原理与所有其他基于将生物分子从一种膜转移到另一种膜的印迹技术相同。

  RNA 样品通过凝胶电泳根据其大小在凝胶上分离。由于 RNA 是单链的,它们可以通过分子间碱基配对形成二级结构。RNA片段的电泳分离因此在变性条件下进行。

  然后将分离的 RNA 片段转移到尼龙膜上。不使用硝酸纤维素膜,因为 RNA 不能有效地与膜结合。

  转移的片段通过固定剂固定在膜上。通过添加与膜上存在的 RNA 序列互补的标记探针来检测膜上的 RNA 片段。

  杂交是检测RNA的基础,作为探针之间杂交的特异性,RNA可以准确识别片段。

  Northern印迹利用RNA片段的大小依赖性分离,因此可用于确定转录物的大小。

  要求

  设备

  琼脂糖凝胶模型

  电源供应

  微波

  离心机

  加热块

  紫外线交联剂

  杂交炉

  杂交容器

  小瓶

  钳子

  移液器

  玻璃管

  材料

  琼脂糖凝胶

  柠檬酸钠

  乙二胺四乙酸二钠盐脱水

  氢氧化钠

  盐酸

  甲醛

  甘油

  溴化乙锭

  溴酚蓝

  RNA梯

  氯化镁2

  氯化钠

  聚乙烯吡咯烷酮

  牛血清白蛋白

  安全数据表

  NaH 2 PO 4

  Tris-HCl

  海卫一X

  数字地面电视

  Taq 缓冲液

  所以聚合酶

  Northern印迹的程序/步骤

  一个。在变性凝胶上分离 RNA

  通过向琼脂糖溶液中加入甲醛来制备 RNA 凝胶溶液。

  将铸模组装好,将制备好的变性凝胶倒入铸模中。随着凝胶开始凝固,添加带有适当齿的梳子以形成孔。

  凝胶凝固后,取下梳子,凝胶在电泳前用电泳缓冲液平衡 30 分钟。

  15 µg RNA 样品与等体积的 RNA 上样缓冲液混合。在相同体积的 RNA 上样缓冲液中加入 3 µg RNA 标记。

  将样品在加热块上于 65°C 温育约 12-15 分钟。

  将样品加载到平衡凝胶中,第一排孔中充满 RNA 标记。

  然后凝胶在 125V 下运行约 3 小时。

变性凝胶上分离 RNA

  将 RNA 从凝胶转移到尼龙膜

  切出比变性凝胶大的尼龙膜,并准备与尼龙膜相同大小的滤纸。

  电泳过程完成后,将 RNA 凝胶从罐中取出并用水冲洗。

  将比凝胶稍大的长方形海绵放在玻璃盘上,盘中加入 SSC 至一定程度,使浸泡过的海绵大约一半浸没在缓冲液中。

  将几张 Whatman 3mm 纸放在海绵顶部并用 SSC 缓冲液润湿。

  然后将凝胶放置在滤纸上,并通过在表面上滚动玻璃吸管将凝胶挤出以去除气泡。

  制备的尼龙膜在不含 RNase 的培养皿上用蒸馏水润湿约 5 分钟。

  将润湿的膜置于凝胶表面,同时避免形成任何气泡。

  表面被 SSC 进一步淹没,并且在膜的顶部放置了更多的滤纸。

  玻璃板放置在结构的顶部,以将所有东西固定到位。该结构被放置过夜以获得有效的转移。

  C。固定化

  转移完成后,取出凝胶并用 SSC 冲洗,并使其干燥。

  将膜置于两张滤纸之间并在真空烘箱中在 80°C 下烘烤 2 小时。

  在某些情况下,可以将膜包裹在紫外线透明塑料包装中,并在紫外线透射仪上照射适当的时间。

  d。杂交

  要使用的 DNA 或 RNA 探针应被标记为 >10 8 dpm/µg 的比活性,并且要去除未掺入的核苷酸。

  携带固定 RNA 的膜用 SSC 润湿。

  将膜放入杂交管中,RNA 朝上,加入 1 ml 甲醛溶液。

  将试管置于杂交烘箱中并在 42°C 下孵育 3 小时。

  如果使用的探针是双链的,则在 100°C 的水浴或培养箱中加热 10 分钟使其变性。

  将所需体积的探针移入杂交管中,并在 42°C 下进一步孵育。

  倒出溶液,并用洗涤溶液洗涤膜。然后在放射自显影下观察膜。

  Northern印迹结果解读

  在射线照相下以条带的形式观察到 RNA 条带。条带与标记的距离可用于确定 RNA 片段的长度和半定量。

  Northern印迹的应用

  该技术可用于识别和分离从不同生物来源收集的 RNA 片段。

  Northern印迹用作检测DNA片段转录的灵敏测试,这些DNA片段将用作Southern印迹中的探针。

  它还允许检测和量化来自不同组织和不同生物体的特定 mRNA。

  Northern印迹被用作与致癌基因过表达和移植排斥过程中的基因表达相关的基因表达研究的工具。

  Northern印迹已被用作诊断克罗恩病等疾病的分子工具。

  该过程被用作检测在病毒感染中起重要作用的病毒微RNA的方法。

  Northern印迹的局限性

  与 RT-PCR 和核酸酶保护测定等其他现代技术相比,Northern 印迹的灵敏度较低。

  该方法需要大量的样本 RNA,这些样本应该是高质量的。

  该技术耗时且复杂,尤其是在要添加多个探针的情况下。


  • 业务咨询

    业务咨询专线:133 7682 0615

    Email:lxyjy@wie-biotech.com

在线留言×