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分子实验-免疫组化结果分析(免疫组化结果如何分析)

2022-01-06 10:24:40
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  一抗4度孵育后为什么要进行37度复温?

  (1)一方面,防止切片从4度直接放入PBS易脱片;

  (2)另一方面,使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

  (3)其实,我更赞同后一种说法,因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后,直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩!

实验室

  DAB显色时间如何把握?

  (1)DAB显色时间不是固定的,主要由显微镜下控制显色时间,到出现浅棕色本底时即可冲洗;

  (2)DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色,这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间;

  (3)此外,若很短时间就出现背景很深,还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间;

  (4)DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色,一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短(一抗4度过夜);另一方面就是封闭时间过长。

  免疫组化结果如何分析?

  (1)阳性着色细胞计数法。在40*光镜下,随机选择不重叠的10个视野,人工或机器计数阳性着色细胞,每组3~6张不同动物组织切片,然后进行组间比较即可。

  (2)灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析,然后进行统计分析即可。

  (3)评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%),zui终可以分数相加,再进行比较。

  对于以上这几种方法,各有利弊,请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。

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