RT-PCR实验原理

　　逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)是基于从组织或细胞中提取总RNA的原理，以mRNA为模板，采用 Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。以cDNA为模板扩增PCR，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。

　　RT-PCR实验优点

　　RT-PCR 比 Northern 杂交更灵敏，对 RNA 的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。

　　RT-PCR实验的实验器具：

　　1、 移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

　　2、 吸头：1ml、200μl、20μl

　　3、 匀浆管：5ml

　　4、 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个

　　5、 EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

　　6、 试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶(广口，带盖)1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇

　　7、 量筒：50ml、250ml、500ml

　　8、 容量瓶：250ml、500ml、1000ml

　　9、 试管架：5ml、1.5ml、20μl

　　10、 盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水

　　11、 铝制饭盒：4个

　　12、 塑料小饭盒：1个

　　13、 大瓷缸：2个

　　14、 锡泊纸：一卷

　　15、 卷纸：2卷

　　16、 三角烧瓶：带盖，稍大

　　RT-PCR实验的具体操作过程如下：

　　1、总 RNA 的提取

　　按照总 RNA 提取实验步骤提取组织或细胞中的总 RNA。

　　2、cDNA 第一链的合成

　　目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

　　(1)在 0.5 ml 微量离心管中，加入总 RNA 1～5 μg，补充适量的 DEPC H2O 使总体积达 11 μl。在管中加 10 μM Oligo(dT)12～18 1 μl，轻轻混匀、离心;

　　(2)70℃ 加热 10 min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min;

　　(3)取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2 μl;上游引物(10 pM)2 μl;下游引物(10 pM)2 μl;dNTP(2 mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl)1 μl。轻轻混匀，离心。42℃ 孵育 2～5 min;

　　(4)加入 SuperⅡ1 μl ,在 42℃ 水浴中孵育 50 min;

　　(5)于 70℃ 加热 15 min 以终止反应;

　　(6)将管插入冰中，加入 RNase H 1 μl，37 ℃ 孵育 20 min，降解残留的 RNA。-20 ℃ 保存备用。

　　3、PCR

　　(1)取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2 μl;上游引物(10 pM)2 μl;下游引物(10 pM)2 μl;dNTP(2 mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl)1 μl;

　　(2)加入适量的 ddH2O，使总体积达 50 μl。轻轻混匀，离心;

　　(3)设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28～32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参(如 G3PD)的特异性引物，同时扩增内参 DNA，作为对照;

　　(4)电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果;

　　(5)密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

　　RT-PCR实验注意事项：

　　1、在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂;

　　2、为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照;

　　3、内参的设定：主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。

　　4、PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。

　　5、防止 DNA 的污染： 采用 DNA 酶处理 RNA;在可能的情况下，将 PCR 引物置于基因的不同外显子，以消除基因和 mRNA 的共线性。

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