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细胞实验:细胞免疫组化实验流程

发布时间:2021-10-01 02:00:01 阅读:18862次 来源:本站

  免疫组织化学又称免疫细胞化学,是通过共价键将酶连接在抗体上,制成酶标抗体,再利用酶对底物的特异催化作用,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位 。目前通常选用免疫酶组化间接染色法进行实验,利用该技术,可进行细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。本文将具体介绍免疫组化的实验流程,为正在做这类实验的科研朋友提供帮助!

  免疫组化(IHC)实验前准备

  1、在实验开始前,要先确保该实验所用到的试剂都准备到位,如:不同浓度梯度的乙醇,PBS 缓冲液,3%过氧化氢,10%正常山羊血清,0.01M 枸橼酸缓冲液,DAB 显色液,二甲苯和抗体等。

  2、本实验所使用到的仪器和耗材有:芬兰百得提供的移液器,赛默飞的 QSP盒装吸头、恒温箱,医用微波炉,盖玻片,镊子,洗瓶,湿盒,切片架等。

  免疫组化(IHC)实验流程

  1、脱蜡复水

  首先对组织切片进行脱蜡复水处理:切片在室温放置 60min 后,浸泡在二甲苯中。10min 后,放入另一个装有二甲苯的染缸再泡 10min。脱蜡后,将组织切片逐级放入无水乙醇、95%、85%,75%,50%的乙醇中,每次处理均为 5min。水合处理后,将组织切片放入纯水中,孵育 5min,再转移放入 PBS 缓冲液中孵育 5min。

  2、抗原修复

  抗原表位修复之前,需进行内源性过氧化物酶的淬灭处理:滴加 3%过氧化氢溶液于切片上,湿盒孵育 10min。用 PBS 浸泡清洗 3 次,每次 5min,尽可能洗去残留的过氧化氢。将切片浸入 0.01M 枸橼酸缓冲液中,微波中大火力加热至沸腾并保持 8min,取出容器,待缓冲液温度自然降到室温。反复 2 次,用PBS 再洗 5min。

  3、免疫反应

  用滤纸擦去周围多余的 PBS,滴加 PBS 稀释好的 10%正常山羊血清,室温湿盒封闭 30-60min。孵育结束后,去除封闭液,滴加一抗工作液,4°C 孵育过夜。第二天,移去一抗后,用 PBS 洗两次,每次 10min.擦去切片周围多余的液体,滴加二抗工作液,室温孵育 30min。弃去二抗后,PBS 洗两次,每次 10min。化学染色去除切片上多余的 PBS,滴加新鲜配制的 DAB 工作液,湿盒孵育,在显微镜下监测染色程度。染色结束后,PBS 浸泡洗去 DAB 染液,每次 5min,重复 3 次。去除残留液体,苏木素复染 2-5min,复染结束后,用水洗去多余染液,在 1%盐酸酒精中分化数秒。再次进行水洗切片。

  4、脱水封片

  此过程刚好和复水相反,首先进行50%乙醇处理5min,然后依次浸泡在75%,85%,95%和无水乙醇中,时间 5min,最后置于二甲苯中进行透明化处理两次, 每次均为 10min。脱水处理后,擦去切片周围的液体,滴上 1 滴中性树胶,盖上盖玻片,用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片,去除气泡以使封片完全。

  5、结果观察

  在显微镜下观察实验结果,并于相同的条件下拍取照片进行后续的结果分析。如图所示,苏木素复染细胞核后,细胞核被染上蓝色,实验组胞浆剪呈现棕黄色, 阳性信号较强;阴性对照组胞浆不被 DAB 染色。

  6、半定量分析

  (1)使用 Image Pro Plus 图像分析软件分析累积光密度值。打开 Image-Pro Plus软件,点击 File,打开实验组和对照组的结果图片。

  (2)点击 Measure。Calibration,点击 Intensity 进行光密度校对。在 Intensity Calibration 窗口中,点击 New,选中 Std.Optical Density,点击 Optical,点击 Image,选择图中最亮的一点。在 Incident Level 中输入与其最接近的整十数,点击 ok。校正光密度后,点击Measure,Count/ Size。在Count Size 窗口,点击Measure,Select Measure,选择测量对象。选中 Area(面积)和 IOD(累积光密度),点击 OK。

  (3)回到Count /Size 窗口,点击Select Color。在Segmentation 窗口,选择Histogram Based,HIS 通道。调节饱和度等参数后,点击 Close。

  (4)选中一张图片,在 Count Size 窗口,点击 View,在 Statistics 窗口可见结果。获得累积光密度值后,可选用相关软件进行统计学分析。

  内容源自:百度学术

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/360.html

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