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精准医疗:生殖支原体的培养与检测方法!

发布时间:2021-10-11 02:16:02 阅读:19572次 来源:本站

  生殖支原体是所有支原体中基因组最小的一种。法国M. Janier指出:在性传播疾病方面,有两个重要发现,其中之一是生殖支原体致病。对生殖支原体生物特性、致病性、抗生素治疗等均有较深入研究。对生殖支原体的认识很早就已开始。

  一、简介

  生殖支原体外观呈烧瓶状,末端有一棒状结构。生殖支原体是所有支原体中基因组最小的一种。最适宜的生长温度为37℃。生长非常缓慢,在一般培养基、液体培养基及有氧情况中不生长,在不含醋酸铊的SP-4培养基中生长。生殖支原体可通过自身的黏附结构黏附于上皮细胞、红细胞的表面,并可在细胞表面滑动,逐步进入上皮细胞及红细胞内致病。

  生殖支原体感染与非淋菌性尿道炎有关。有人用PCR技术检测非淋菌性尿道炎,衣原体阳性患者尿中生殖支原体阳性率为28%,而衣原体阴性患者尿中生殖器支原体阳性率仅为7%。

  二、培养检测方法

  Mg对培养基要求极高且生长缓慢,培养较难。尤其是临床标本中Mg的培养更不容易成功。

  1、分离培养法

  (1)培养基培养

  Mg对培养基要求极高且生长缓慢,培养较难,尤其是临床标本中Mg的培养更不容易成功。Tully1981年建立了对医学支原体具有重要意义的SP-4培养基。适合于Mg生长的SP-4培养基,不含醋酸铊,含Mg代谢所需的葡萄糖及其它营养成份,最适pH为7.4-7.5,可通过加入0.8%Noble琼脂或0.5~0.6%琼脂而固体化,用于克隆菌株,观察菌落,Tully等利用这种培养基,从13份尿道分泌物标本中分离培养获得2株Mg,培养期约为50天。

  (2)组织细胞培养法

  组织细胞培养支原体,可为支原体提供良好的类似体内的生长环境。早在60年代,Chanock等报道了肺炎支原体(Mp)在组织细胞中的生长。90年代,Jensen等开始尝试用细胞培养法来进行Mg的繁殖,并借此在电镜下观察到Mg侵入细胞的过程以及在细胞内的定位。在PCR的监测下,Jensec发现在11分PCR检测MgDNA阳性的尿道标本中,有9份适应在Vero细胞磁头中增殖,经过多次传代培养后转入改良的Friis fF肉汤培养基中,有6份能继续传代生长,最终在琼脂培养基中克隆获得4株。Jensen认为,在分离获得新的Mg菌株方面,细胞培养繁殖过程起到了三方面的作用,一是使临床标本中的Mg逐渐适应在人工培养基中生长,二是增加了接种于支原体肉汤培养基中的支原体数量,三是提供持续的接种源。

  2、血清学方法

  根据Mg的免疫学特性,人们建立了用检测Mg抗体和检测与鉴定Mg抗原的血清学方法。

  Furr等于1984年详细报道了检测Mg抗体的MIF技术。Moller等对31例未检测出Ct和Mh血清抗体的急性盆腔炎患者,用MIF检测Mg抗体,发现其中大约40%在发病后一个月内抗体滴度有4倍或4倍以上的改变。Taylor-Robinson等报道应用间接MIF检测NGU患者Mg抗体,认为间接MIF试验是一种具有足够敏感性、特异性和简便易行的检测方法。Jensen等曾用EIA检测有尿道炎症与无尿道炎症状的男性STD患者急性期血样标本中Mg抗体,结果发现反应性较弱,且与Mp存在广泛的交叉反应。

  根据特异性抗体能阻止支原体的生长及代谢这一特性,可采用已知高价血涉及进行祖先生长及代谢抑制试验以鉴别支原体。赵季文等曾采用MIT鉴定所分离获得的Mg菌株。

  暴露于支原体表面的脂结合膜蛋白(lipid-associated membrane proteins,LAMPs是一种支原体种属特异性抗原,具有高抗原性,且不同菌株的支原体,其LAMP抗体具有高度种属特异性,与其它种属无交叉反应。)因此提取Mg的LAMP建立ELISA方法检测Mg抗体,可消除Mg与Mp之间的交叉反应。

  3、分子生物学方法

  DNA探针和聚合酶链反应(PCR)检测Mg的方法,克服了前两类检测方法的弊端,为研究Mg与疾病的病因学关系提供了有力的手段。

精准医疗

  (1)DNA探针技术

  1987年Hyman用PUCB载体构建成Mg基因文库,并从中筛选制备出特异性DNA探针,通过斑点杂交,可检测仅含0.1ng的特异性支原体DNA,即105CFU。

  (2)聚合酶链反应(PCR)技术

  PCR是一种新的基因诊断技术,灵敏度高,特异性强,且快速、简便。1990年,PCR技术开始在医学支原领域应用。

  早期的引物多参照菌体末端特异性粘附蛋白的DNA序列而设计。Palmer等体外扩增Mg粘附蛋白的部分核苷酸序列,3株Mg均出现37bp的DNA片断,并证明PCR技术可检测到10-15g的mg-DNA,其引物序列的:

  mg1:5'TGT CTA TGACCA GTA TGT AC3'

  mg2:5'CTG CTT TGG TCA AGA CAT CA3'

  1991年Jensen等根据Mg的粘附蛋白基因设计合成了如下组引物:

  mgPa-1 5'AGA TGA TGA AAC CCT AAC CCC TTG G3'

  mgPa-1 5'GAC CAT CAA GGT ATT TCT CAA CAG C3'

  mgPa-1 5'CCG AGG GGT TTT CCA TTT TTG C3'

  用MgPa-1 和MgPa-3成功地扩增出Mg的281bpDNA片段,5个临床分离株扩增出同样的产生,而其他支原体和细菌均为阴性,用MgPa-2作探针,对扩增产物经Southern eP印迹杂交,均为阳性,证明引物具有特异性,共检出下降大约有50个Mg细胞。1993年Jensen等又根据Mg粘膜蛋白基因设计了另一对引物,即:

  mg粘附蛋白基因设计了另一对引物,即:

  mgPa-476:5‘ATG GCG AGC CTA TCT TTG ATC CTT TAA 3’

  mgPa-903:5‘TTC ACC TCC CCA CTA CTG TCC TAA TGC3’

  用来证实和补充引物MgPa-1和MgPa-3所扩增的结果,其扩增片段为453bp。研究发现,这两对Mg粘附蛋白引物的敏感性完全一致。用这种方法检测99例尿道炎病人的尿道拭子,结果17例Mg阳性,而用培养法无一例阳性。

  4、小结

  微生物感染诊断的“金标准”是培养法,然而Mg培养成功率极低,有待于对培养基进行进一步的研究和改良,以促进Mg在其中的生长;此外,将细胞株引入Mg的培养可能是一个较好的方法,有必要加强这方面的探索和研究。免疫学检测方法因支原体种属间易出现交叉反应以及对抗原、抗体纯度要求较高而在实际应用上受到一定限制,若能研究建立快速、灵敏、特异的检测临床标本中Mg抗原的方法,则具有较大的实用价值。PCR技术是一个简单而又直接的检测Mg方法,正被日益广泛地采用,主要用于Mg感染的早期诊断或急性感染的诊断及各种人群中Mg的流行病学研究。但在应用时应注意:①临床标本中Mg含量低,DNA纯度不够,抑制物过多,TaqDNA聚合酶活性低均会引起假阴性,应进一步完善模板DNA的提取技术;②因PCR灵敏度极高,在整个操作过程中均应严格避免PCR产物的污染,以减少假阳性。

  三、危害

  1、Mg与非淋菌性尿道炎(NGU)

  在性活跃的年轻人群中泌尿生殖道异常与Mg卫之间有强相关性,有症状患者中Mg阳性率高达12%。一项对335例有尿道炎症状的男性患者进行相关致病原的检测研究结果强烈支持Mg在男性尿道炎中的致病作用。许多病例对照研究显示急性NGU患者的Mg感染率明显高于对照组,提示Mg是急性NGU的高危因素,并且发现感染Mg的患者比感染沙眼农原体(Ct)的患者更容易出现尿道炎症状,提示Mg可能是尿道中独立于ct的致病因子,去除ct因素后,Mg与NGU的相关性有所提高,进一步说明了Mg在NGU中有独立的致病性。临床上许多有症状的复发性NGU患者经抗生素治疗后Mg仍阳性,提示Mg持续存在于尿道可能是导致NGU复发的原因。

  2、Mg与前列腺炎

  半数男性在一生中至少出现过1次前列腺炎症状,但90%的患者找不到明确病因,推测前列腺可能藏匿了不易被传统技术检测到的微生物。PCR检测慢性顽固性前列腺炎患者中的病原体,结果显示Mg感染与慢性前列腺炎可能有一定联系。另外Mg在慢性前列腺患者精液中检测率亦高于正常健康人群。但Mg在前列腺炎中的致病作用目前还不确定。

  3、Mg与女性生殖道感染

  (1)Mg与细菌性阴道病

  有研究者对细菌性阴道病患者进行Mg检测,但未发现Mg与细菌性阴道病之问有明显联系。

  (2)Mg与黏液脓性宫颈炎(mucopurulent cervicitis,MPC)

  对非洲西部826位女性性工作者进行大样本临床研究发现其中26.3%感染有Mg,并发现Mg与宫颈炎相关。Mg感染作为引起宫颈炎症的独立致病因子,是MPC的高危因素,故有必要将Mg考虑为MPC(尤其是未发现NG和Ct感染的MPC)潜在的重要病原体。

  (3)Mg与子宫内膜炎

  58例组织学已经证实为子宫内膜炎的患者中有9例检测Mg阳性,显示Mg感染与子宫内膜炎存在一定关联。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/366.html

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