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真核DNA分离方案(真核生物dna的提取实验)

2022-01-24 09:57:59
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  脱氧核糖核酸 (DNA) 提取是将 DNA 从细胞中的蛋白质、膜和其他细胞材料中分离出来的过程。

  在真核细胞中,例如人类和植物细胞,DNA 在称为细胞核的细胞器中组织为染色体。

  这些细胞还具有脂质双层外膜和含有各种类型和功能的蛋白质、糖、脂质和无机离子的细胞质。真核细胞还包含其他称为细胞器的膜封闭区室。

  因此,为了从这些细胞中分离 DNA,三个必要的基本步骤包括:

  1) 裂解

  2) 降水

  3) 净化

  真核DNA分离原理

  DNA 分离的第一步是细胞裂解,其中细胞和细胞核被打开以释放内部的 DNA。这可以通过机械破坏方法(使用组织匀浆器(如小型搅拌机)、研钵和杵,将组织切成小块)或通过使用洗涤剂和酶(如蛋白酶 K)裂解以释放 DNA 和溶解细胞蛋白质。提取缓冲液通常用于由 50mM Tris、pH 8、25mM EDTA、200mM NaCl、1% SDS 等组成的过程中。

  Tris 缓冲液有助于维持 pH 值。

  EDTA 结合二价金属离子(Ca2+、Mg2+、Mn2+),这些离子可以与 DNA 的阴离子 PO43-基团形成盐。它还破坏细胞膜的稳定性,防止 DNA 沉淀并抑制 DNA 酶。

  NaCl 有助于松开细胞壁,以增加 DNA 的溶解度和稳定性。它还可以使 DNA 从酒精溶液中沉淀出来,因为它屏蔽了 DNA 的负磷酸末端,使 DNA 链更靠近在一起。

  SDS 是一种阴离子去污剂,可破坏蛋白质之间的离子相互作用。

  液体洗涤剂通过乳化细胞的脂质和蛋白质并破坏将细胞膜结合在一起的键,导致细胞膜分解。去污剂还会使脂质和蛋白质从溶液中沉淀出来。

  从被破坏的细胞中释放的 DNA 最终被冷无水乙醇或异丙醇沉淀。

  DNA 可溶于洗碗剂溶液,但如果加入乙醇则不溶。添加酒精会沉淀 DNA,因为它会导致滤液中的所有成分都留在溶液中,但 DNA 除外。

真核dna

  真核DNA分离的材料和试剂

  5mL 微量离心管

  水浴 80 o C

  异丙醇(室温)

  70% 乙醇(室温)

  裂解液

  RNA酶溶液

  蛋白质沉淀溶液

  吸水纸

  真核DNA分离程序

  根据手头的样品(动物细胞或植物细胞),进行细胞裂解。

  在裂解液中加入 3µL RNase 溶液

  将试管倒置 2-5 次以混合样品

  在 37 o C 下孵育混合物(15-30 分钟)

  冷却至室温约5分钟

  加入 200 µL 蛋白沉淀溶液并高速涡旋(20 秒)。

  冷却样品约 5 分钟

  以 13,000-16,000 xg 离心(4 分钟)

  在形成白色颗粒时,去除上清液。

  将 DNA 转移到 1.5mL 微量离心管中,室温为 600µL。将异丙醇加入试管中进行沉淀。

  轻轻倒置管以混合溶液。

  白色线状 DNA 链形成可见质量

  13,000-16,000 xg 离心机(室温下 1 分钟)

  在形成小的白色颗粒时,倒出上清液

  加入 100µL 室温 70% 乙醇

  将试管倒置数次(洗涤 DNA)

  13,000-16,000 xg 离心机(室温下 1 分钟)

  吸出乙醇

  在干净的吸水纸上倒置管

  风干颗粒(10-15 分钟)

  加入 100µL DNA 水化溶液

  在 65 o C 下孵育 1 小时(DNA 再水化)

  储存 DNA (2-8 o C)

  DNA浓度可以通过用分光光度计测量溶液在600nm处的吸光度强度并与已知DNA浓度的标准曲线进行比较来确定。DNA 吸收 260 和 280 nm 的紫外光,而蛋白质吸收 280 nm 的紫外光。

  真核 DNA 分离的预期结果

  白色线状 DNA 链或白色颗粒

  关于分光光度法,

  纯 DNA = 1.8

  蛋白质 < 1.8 的 DNA

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