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怎么做组织块法原代培养实验(实验步骤及注意事项有哪些)

发布时间:2022-06-20 10:40:07 阅读:111042次 来源:百度学术

  组织块法原代培养实验原理

  组织块法原代培养的基本原理是将将刚离体的、有旺盛生长活力的组织剪成小块,接种于培养瓶中,新生的细胞大约 24 h 后可从贴壁的组织块四周游出并生长。

  利用此法进行的原代培养,操作过程简便、易行,培养的细胞较易存活。

  组织块法原代培养实验材料与仪器

  器材:

  ① 大鼠

  ② 眼科剪、眼科镊

  ③ 培养皿、培养瓶

  ④ 弯头吸管

  ⑤ DMEM 培养基

  试剂:

  ① 75% 乙醇

  ② D-Hanks 液

  组织块法原代培养实验步骤

  组织块法原代培养实验的基本过程可分为以下几步:(以新生大鼠肝细胞的原代培养为例)

  A. 用 75% 乙醇棉球反复擦拭新生大鼠全身 3 遍。

  B. 将大鼠移入超净工作台后,再用 75% 乙醇擦拭 1 次。

  C. 处死大鼠(断头法),用眼科剪打开腹腔,取出肝组织,置于培养皿中。

  D. 用 D-Hanks 液反复冲洗肝组织 3 遍,去除血细胞。

  E. 为避免杂细胞的污染,需用眼科镊将肝组织块上所附的结缔组织尽可能去除。

  F. 将肝组织移入一新的培养皿中,滴 0.5 mL 培养基于肝组织上,用眼科剪将其剪成 1 mm3 左右的小块,同时用眼科镊将其彼此分开。

  G. 用弯头吸管将剪碎的肝组织块吸起,移入培养瓶底部。

  H. 用弯头吸管头移动肝组织块,使其均匀分布于培养瓶底部,小块间距控制在 0.5 cm 左右,数量为 15~20 块/培养瓶(25 mL)。

  I. 吸取少量培养基,沿培养瓶颈缓缓滴入,培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。

  J. 将培养瓶轻轻放入培养箱中培养。

  K. 24 h 后,可观察到有少量细胞从组织块周围游离而出,视需要补以少量培养基。

  组织块法原代培养实验注意事项

  1. D-Hanks 液对肝组织的冲洗要充分,尽量去除血细胞,避免其溶血后对肝细胞的生长产生影响。

  2. 组织块的体积应控制在 1 mm3 左右,这样其中心部位的细胞才可获得充足的养分。体积过大的组织块其中心部位细胞常会因营养不足而发生死亡、溶解,由此会对周围细胞的生长产生影响。

  3. 培养瓶中组织块摆放的密度不能过大,否则细胞将会因为营养不足而活性不佳。此外,为了避免组织块漂浮、不贴壁,第一次加入培养基的量要少,而在移动和观察细胞时,动作也要轻,因为培养基的振荡也会影响组织块的贴壁。

  4. 由于原代培养过程较长,因此,应严格无菌操作,避免细菌、霉菌等的污染。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/1286.html

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