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分子实验-荧光定量PCR原理(如何实现对初始模板的定量)

2021-12-31 10:35:48
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  在PCR反应体系中加入荧光基团,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环收集一个荧光强度信号,通过荧光强度变化检测产物量的变化,最终得到得到一条荧光扩增曲线图,扩增曲线横坐标表示循环数,纵坐标表示荧光强度。

qPCR扩增曲线

图1:qPCR扩增曲线

  一般而言,荧光扩增曲线可以分为三个阶段:荧光背景信号阶段(基线期)、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化;在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加,PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,根据最终的PCR产物量也不能计算出起始DNA拷贝数;只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。

  荧光定量PCR常用术语

  在了解荧光定量PCR如何对初始模板进行定量之前,需要了解几个在荧光定量PCR分析中常用的术语:

  基线:实时荧光定量PCR反应的基线是指在PCR的最初几个循环中(一般为3-15个循环)的信号水平。此阶段的荧光信号变化量极小。低水平的基线信号相当于反应的背景或噪声。每个实时荧光定量PCR反应的基线应通过用户分析或扩增曲线自动分析,根据经验确定。基线的设置,会影响到荧光阈值及Ct值。

  荧光阈值:荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,一般荧光阈值默认是PCR 3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。

  Ct值:Ct值指的是PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环数。

  标准曲线:标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。对已知拷贝数的标准样品做系列稀释,对不同稀释度的标准样品进行荧光定量PCR并记录Ct值,根据Ct值及拷贝数的对数绘制得到标准曲线,标准曲线的纵坐标代表起始拷贝数的对数,横坐标代Ct值。

  如何实现对初始模板的定量

  利用实时荧光定量PCR对样品的初始模板量进行定量分析,需要利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线,再通过荧光定量PCR获得未知样品的Ct值,最后从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

对初始模板进行定量分析

图2:对初始模板进行定量分析

  标准曲线绘制

  标准品的制备

  设计特定引物,利用PCR对目的基因片段进行扩增,随后将目的基因片段克隆至载体中,测序验证是否为阳性重组质粒,最后收集阳性克隆质粒作为标准品。

  绘制标准曲线

  测定质粒的浓度,依据公式计算出质粒的拷贝数。对质粒进行系列稀释,分别作为模板进行荧光定量PCR并记录Ct值。最后依据起始拷贝数的对数及Ct值绘制标准曲线,得到标准方程。当需要对起始模板进行定量时,只需要得到扩增曲线,读得Ct值,带入标准方程即可对起始模板定量。


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