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分子实验-Western blot实验结果是阴性怎么办

发布时间:2021-12-31 10:32:41 阅读:16422次 来源:百度学术

  Western blot是最常用的实验方法,但意义并不寻常,其结果的有无往往决定着下一步实验的走向。当您辛辛苦苦地花费近两天时间提蛋白、电泳、转印、杂交之后,显色时却得到了“白板”一块,伤心沮丧之时,千万不要轻言放弃!请务必先试试我的建议:

  1. 打开冰箱,看看有没有其他显色试剂

  2. 走进隔壁,换换其他实验室的成像仪器

  ——也许,惊喜便这样悄然而至,幸福就在那转角处!

  对实验而言,幸福各有不同,而不幸往往相似。这一切都是由于那该死的“灵敏度”!

  最初的沮丧和险些的错过,并不完全是您的过错。千万别被实验折磨之余,再背负太多的自责,因为原因有很多。

  1. 敌人太过狡猾

  您研究的对象是蛋白质,这个敌人可不简单。其表达丰度变化跨度极大,据估计有106之巨。不仅如此,真正执行功能的蛋白,其表达量往往极微,些许的丰度变化就能带来生命现象的斗转星移。面对这样的复杂而狡猾的蛋白质,我们却罕有大规模杀伤性武器,既没有PCR般的扩增技术,也没有成熟的测序方法。无奈,依靠印迹这个还算特异性好的常规武器,其杀伤力又往往受制于仪器和试剂。

  2. 试剂良莠不齐

  说到试剂,国产、进口,那叫一个林林总总,价格差别也很大。很多实验室老板“买得起马,配不起鞍”,最终选择便宜的试剂,当然,并不是便宜没好货,只是更多的时候,是一分钱一分货。殊不知这一省,就省掉了一两个数量级的灵敏度差异。

  3. 仪器表现迥异

  我们科研工作者,多为生物学出身,对仪器硬件、光学电学有着天然的不亲近感。购买仪器时,更是坠入了诸多参数的谜团,面对几十项不知所云的陌生数字,最终要么是举手投降,简单地copy了其他实验室的选择;要么是眉毛胡子*,本着“一个都不能少”的原则,教条地比较每一项参数,最后费尽心力地选他个所谓的“”。殊不知,参数有主次之分,其权重各异;即便参数相当,真真地做个对比实验,不同厂商的“”,也会比出个一两个数量级的灵敏度差别。因此,选择仪器时我个人认同那句话,“不认广告,认疗效”,也就是说只看关键指标,再加上实际使用效果的比较,相信错不了。

  做蛋白的实验许多年,碰到过“白板”、比较过试剂,也选购过价格不菲的仪器,有些许的感受,这里和同行们做个分享。

  1 选个灵敏的试剂

  常用的DAB、NBT/BCIP等比色法,操作虽简单,不需仪器或胶片成像,但灵敏度和动态范围实在太差。用此法得到的阴性结果,还有起死回生的余地。因此,选择化学发光或荧光的方法。

  化学发光方法是由原Amersham公司发明并引入科研的,目前已经被广为使用。化学发光的灵敏度是比色法的100-10000倍,动态范围更是宽了1-2个数量级。之后不同厂家在此领域进行研发,经过底物的改良和试剂的优化,最终在灵敏度和持续发光时间上都有了显著的改善。选择试剂不仅可以提高一个数量级的灵敏度,还可使一抗的使用量降低到原来的1/20。因此,在选择试剂的时候,要视情况而定,对灵敏度要求不高时,选用常规的试剂,经济实惠;但如果蛋白丰度低、一抗又极其珍贵,那就得毫不吝惜地选择试剂,要知道有时一抗是资源,那可是拿钱买不来的。

  实验

  如果再“不差钱”,还可以选择荧光,来他个彩色Western。结果好看在其次,关键是省事儿,目标蛋白和内参的杂交同时完成、成像一步到位。当然这是要付出经济代价的,荧光试剂可比ECL试剂贵不少。

  2 选个可靠的仪器

  随着CCD的发展,数码相机已经走进了每个人的生活,其便捷性已经促使我们告别了胶片时代。实验室也一样,做Western不用再费事地配显影液,不用在暗室小心地摆弄曝光夹。CCD成像仪便可让一切变轻松,无需摸索曝光时间,只需把膜往里一扔,设定好时间间隔,仪器自动得到不同累计时间的图像。我们要做的只是轻松地对着电脑,选择一张不明不暗、长相漂亮的图像就ok啦。

  这事说着挺美,但是也得选个可靠的仪器才能实现,其中也有不少学问。这里先跟大家解释几个概念和参数:

  何为CCD?

  CCD可是个关键部件,没有它根本就不会有今天的数码成像。CCD的全名叫“Charge Coupled Device”,说白了就是光信号的接收器,它能把光信号转变成电信号,最终变为我们数字化的图像。它的大小直接决定了图像的最高分辨率,也就是我们常说的几百万像素。CCD可是个值钱的部件,面积大一点,价格没准会翻一番。

  CCD在成像仪中是非常重要的组成部分,在这个小小的器件上也有很大的技术革新,如让CCD像素做45度角的旋转,以便获得分辨率更好的图像等等。这类问题太专业,不是我们轻易可以理解的。因此在这个问题是,我的建议是“不求弄懂,只抓主流”,也就是认准的主流品牌,选择有研发和生产CCD能力的一线厂商的成像仪,如Fuji、Kodak。道理很简单,自己给自己用的东西,肯定是质量又好又便宜。

  何为冷CCD?

  实验室用相机与家用相机不同,用到的是冷CCD,也就是说需要给CCD降温到零下二三十度。这是为什么?原因有二,一是生物样本的发光量实在太少,信号太微弱,需要相对长的曝光时间;二是CCD等光电器件,都有不可避免的系统噪音,一旦曝光时间长,噪音累计起来,积少成多,会对本就微弱的样品信号造成干扰。而给CCD降温后,其系统噪音可大大降低。

  何为 f 值?

  对这个参数的深刻认识,得益于一次采购Canon单反镜头,同一系列f1.2、f1.4、f1.8的镜头,价格分别是人民币14000、2500、700,这期间的巨大差别,当时是“雷到”我了。回来后好好研究,才了解到这是一个表征镜头光圈大小的指标,f值越小则镜头光圈越大,也就是说单位时间内进光量越大,镜头进光量与f值的平方成反。举个例子,f1.2与f1.8,虽然f值只小了0.6,但是进光量面积却增加了一倍!(如图2) 所以千万别小看了这个参数,它极大地影响着成像的速度和质量,怪不得不同参数的镜头价格,一个天上、一个地下。

  话说远了,回到成像仪上来。成像设备,镜头无疑是最重要的部件,而镜头的诸多参数中我认为这个最重要。因为刚才我们说到过,生物样本发光量低,为了能够检测到清晰的样品信号,我们连微小的系统噪音都得靠低温严加控制,那么对于最关键的采集信号的光学部件,这个参数的考量绝不能含糊!据我所知,目前化学发光成像仪最大的镜头是f 0.85,对于这种常用设备,千万别忽视了这个参数,否则发生之前提到的不幸一幕就不足为奇了。

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