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细胞转染实验步骤(细胞转染原理及技巧分享)

2022-04-25 10:34:24
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  细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、病毒介导的转染等,理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤,以及利用核转仪进行转染的方法学对照等。

细胞转染实验步骤(细胞转染原理及技巧分享)

  一、脂质体(Liposome)转染方法原理

  脂质体作为体内和体外输送载体的工具,已经研究的十分广泛,中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA,借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体,DNA并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物,从而吸附到带负电的细胞膜表面,经过内吞被导入细胞。

细胞转染实验步骤

  优点:与其它方法相比,有较高的效率和较好的重复性,它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方便的转染方法之一。二、脂质体转染操作步骤

  (1)细胞培养:取6cm细胞皿,向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液,37℃ CO2培养密度至40%~60%,密度过大,转染后不利筛选细胞。

  (2) 转染液制备:在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)

  A液:用不含血清培养基稀释1ug 质粒DNA。

  B液:用不含血清培养基稀释2ul脂质体。

  分别将A液与B液轻弹混匀,静置5分钟。

  (3)吸取B液加入至A液中,轻弹混匀。室温中置10-15分钟。

  (4)转染准备:用1mL不含血清培养液漂洗两次,再加入4mL不含血清培养液。

  (5)转染:把A/B复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37℃温箱置6~24小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。

  (6)瞬时转染后,可在48h-72h细胞长满之后,提取细胞蛋白或者RNA,验证敲减/过表达效率。

  利用核转仪进行转染:

  LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统是结合电穿孔技术和细胞特异性转染液,通过系统内置优化的转染程序,将外源基因高效导入目标细胞的细胞质中,并可直接入核,整合到细胞染色体中。

转染

  Nucleofector核转系统可用于免疫细胞、干细胞、神经细胞、内皮细胞等较难转染的原代细胞和各类细胞系中,其不依赖于病毒感染、不依赖于细胞有丝分裂,可加快基因表达,已成功转染1200余种细胞系、130余种原代细胞,多数细胞系转染效率可高达50-70%,部分原代细胞转染效率可超过90%。目前,LONZA 4D-Nucleofector已大量应用于CAR-T细胞的研究中。

Nucleofector细胞核转染系统

  图.用Nucleofector细胞核转染系统,将GFP标记的质粒转染新生儿皮肤成纤维细胞(NHDF-neo),2小时后用3.5% PFA 固定,共聚焦显微镜可观察到GFP蛋白在细胞核内表达。

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