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细胞免疫组化实验步骤(免疫组化IHC实验流程)

发布时间:2022-04-25 10:28:32 阅读:114222次 来源:百度学术

  免疫组化流程图

免疫组化流程图

  免疫组化的标本主要是组织标本和细胞标本两大类。组织标本中包括石蜡切片(标本制作的首选方法)和冰冻切片。一般而言,石蜡切片要求薄厚均匀,切片完整,且无褶无刀痕。

  1)脱蜡与水化:将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min,这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化,好让组织切片牢固地贴在玻片上。而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min,乙醇梯度(高至低:100%、95%、80%、70%)各2min,水洗5min(不要直接对着切片冲洗)。PBS洗3次,3 min/次。

免疫组化实验

  2)细胞通透与封闭:用预热的封闭通透液(40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2)浸润切片30min(RT 避光),降低内源性过氧化物酶的活性。PBS洗3次,3 min/次。

  3)抗原修复:由于制作石蜡切片时,甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性,这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。

  这里常用微波修复,pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片,在微波炉里高火4min至沸腾后,取出自然冷却至室温,重复2次,每次补足液体以免干片。(当然有的朋友用酶修复法也是可以的)。PBS洗3次,3 min/次。

  4)血清封闭:用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈,并对圈内的组织滴加稀释好的血清,37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。

  5)孵育一抗:对圈内的组织(面积为1×1)滴加稀释好的一抗20ul,4℃过夜或者37℃ 1-2h。PBS洗3次,3 min/次。(一般4℃过夜后,需要将切片放置37℃复温45min,防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定)

  6)孵育二抗:对圈内的组织(面积为1×1)滴加稀释好的二抗20ul,37℃ 1-2h,PBS洗3次,3 min/次。

  7)切片显色:用DAB-H2O2显色10min,显色液最好是现用现配,此时要通过显微镜观察染色是否明显,10min内即可用蒸馏水终止显色。

  8)复染及封片:为了形成细胞轮廓,更好的定位目标蛋白,可用Mayer苏木素染色30s,水洗,盐酸酒精分化2s,流水浸入15min。脱水时,乙醇梯度(由低至高:50%、70%、95%、100%)各2min。二甲苯5min使切片透明化,最后加入中性树胶封片(一般封片后最好立即拍照,若不能及时拍照,可用指甲油封固并保持好避光和湿度)。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/1086.html

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