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流式细胞术检查免疫细胞活化的三种最常用的方法

发布时间:2022-04-24 10:43:21 阅读:15392次 来源:本站

  研究免疫细胞活化使科学家能够了解身体对特定感染、自身免疫性疾病或癌症的反应方式。这些知识在开发更有效的疫苗和疗法方面发挥着直接作用。

  在捕获有关免疫细胞激活的信息时,流式细胞仪因其多功能性、用户友好性和易于数据生成而仍然是黄金标准。将时间拨回到 1970 年代,免疫学家 Len Herzenberg 正在使用显微镜研究他的荧光标记的单克隆抗体。1不幸的是,这很耗时,而且他的视力很差。Herzenberg 意识到他可以在 Mack Fulwyler 的洛斯阿拉莫斯分选机上添加一个光源和一个光电倍增管,于是荧光激活细胞分选机 (FACS) 机器诞生了。

  现在,术语“流式细胞仪”通常用于描述分析仪和分选仪,因为术语“FACS”实际上已商业化。2流式细胞仪分析单个事件并以每秒数千个事件的速率记录多个参数。对这些数据集的查询允许在很短的时间内量化数千个细胞,从而产生统计上可靠的数据。现在有可用的机器可用于查看多达 27 种不同的荧光染料,这开辟了免疫学领域。

  是时候随波逐流了!

  在开始免疫细胞激活实验之前,需要考虑几个参数。首先,您需要能够为您的检测识别感兴趣的细胞,无论这意味着将它们从混合细胞群中分离出来,还是使用细胞表面标记将它们与其他细胞类型区分开来。

  此外,您选择的刺激方法(例如,靶细胞、化学物质、抗原肽)将影响您测量发生的激活的方式。例如,如果用靶细胞刺激感兴趣的细胞(寻找细胞毒性能力),脱粒试验会更合适,而化学和抗原刺激将优先用于增殖研究。

  最后,请注意激活免疫细胞会导致表型、基因调控和可能的功能发生变化。

图例

  以下是通过流式细胞术检查免疫细胞活化的三种最常用的方法。

  1. 表面抗体染色

  在遇到病原体之前,免疫细胞处于静止/静止状态。外来病原体的刺激或暴露于促炎环境会导致细胞内信号级联反应,最终导致基因变化,从而导致细胞表面蛋白的改变。3

  例如,当呈递适当的抗原时,幼稚 T 细胞将被刺激呈递有助于这种新分化的效应细胞增殖的成熟标志物(例如,CD69 和 CD25)。可以使用流式细胞术测量表面蛋白表达的变化。有关细胞功能的更多信息(例如增殖、促炎/抗炎细胞因子产生、细胞毒性蛋白产生),您还可以将表面抗体染色与细胞内细胞因子染色结合起来。

  2. 细胞内细胞因子染色

  任何免疫反应都有 4 个主要特征:(1)热量(热量);(2)dalor(痛苦);(3) 肿瘤(肿胀);(4) rubor (发红)。4这些物理属性是免疫细胞涌入感染部位的直接结果,因为遇到异物的前哨细胞会释放细胞因子。细胞因子(细胞 = 细胞;kine = 运动/运动)是在细胞间通讯、免疫细胞运输和环境环境设置(即促炎与抗炎)中很重要的小蛋白质。

  细胞因子测量使研究人员能够研究对特定抗原刺激的反应,而流式细胞术的使用提供了确定哪些特定细胞类型正在产生哪些细胞因子的能力。为此,首先用阻断蛋白质转运的试剂(例如 b refeldin A 或莫能菌素5 )处理受刺激的细胞,然后固定和透化以使您的细胞因子特异性抗体达到其目标。确保使用直接与“明亮”荧光团偶联的抗体来标记细胞内细胞因子(例如 GFP/FITC、PE 等)——它们通常不如细胞表面蛋白丰富,因此这将为您提供最佳机会检测他们的存在!

  3. 细胞增殖

  在对病原体做出反应后,免疫细胞将被激活并增殖以增加其种群数量。这是一个重要的研究点,特别是在试图揭示特定感染期间哪些免疫细胞群扩张最多,或年龄如何在细胞激活反应中发挥作用时。

  Ki-67:核蛋白 Ki-67 是一种常用于测量细胞增殖的标记物,因为它在细胞周期的活跃期被上调。6虽然与其他方法相比,它非常易于使用,但研究人员经常抱怨背景高——这是在细胞仪上进行实验设置以及数据分析期间要牢记的重要一点。此外,与细胞内细胞因子染色类似,一定要使用带有直接缀合的“明亮”荧光团的抗 Ki-67 抗体——让我们确保您检测到增殖!

  BrdU:研究增殖的一种方法是标记正在复制的 DNA。传统上,这是使用放射性标记的胸苷7完成的,它可以在复制过程中掺入 DNA 中,然后使用液体闪烁检测。然而,基于放射性的测定具有巨大的缺点。为了避免这种危险,开发了胸苷类似物 5'-bromo-2'deoxyuridine (BrdU)。7 BrdU 也可以在 S 期而不是胸苷掺入到复制细胞的新合成 DNA 中。与荧光标签偶联的抗 BrdU 抗体用于通过流式细胞术检测 BrdU。然而,由于它取代了胸苷,BrdU 会导致 DNA 突变。

  染料稀释法:染料稀释法利用羧基荧光素 N-羟基琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 等染料对细胞蛋白进行荧光标记。CFSE 是一种细胞渗透性染料,可与细胞内分子共价偶联,以将 CFSE 长时间保留在细胞内。8随着细胞分裂,CFSE 也随之分裂,导致每次细胞分裂都被观察为前一阶段的 CFSE 荧光减半。

  这种简单的检测方法易于设置,可以与流式细胞仪上的其他细胞表面染色结合使用。CFSE 可能非常明亮,因此在与其他荧光染料结合使用时需要小心,以确保使用正确的补偿和门控控制。因为 CFSE 和 GFP 具有相同的激发/发射光谱,所以它们不能在同一个实验中一起使用是很重要的。还有其他类似于 CFSE 的染料用于研究染料稀释方法,但具有不同的激发和发射曲线,因此可以与 GFP 或其他荧光蛋白结合使用。

  流式细胞术是研究多种条件下免疫细胞活化的重要工具。由于流式细胞术允许用户每秒检查数千个细胞,因此可以非常快速地收集大量数据。随着更经济实惠的流式细胞仪和更多荧光染料的出现,测量免疫细胞活化从未如此简单。


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